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Feulgen反應(yīng)原理及Sohiff液的配制
點(diǎn)擊次數(shù)：2017 發(fā)布時(shí)間：2015-1-30
Feulgen 反應(yīng)原理及 Sohiff 液的配制
Feulgen 反應(yīng)是顯示DNA的經(jīng)典而特異的染色方法，由Feulgen(孚爾根)在1924年提出,，因而得名,。
(一)Feulgen反應(yīng)原理
DNA 可在酸性條件下水解，嘌呤―脫氧核糖之間的糖苷鍵斷開,，形成醛基(―CHO),，再用 顯示醛基的特異性試劑Schiff試劑處理，形成光鏡下所見的細(xì)胞核內(nèi)紫紅色反應(yīng)產(chǎn)物,。DNA 經(jīng)稀鹽酸處理而水解,。除可破壞脫氧核糖與嘌呤堿外，還可水解嘧啶堿,。酸水解核酸的程度與 水解時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān),，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)，嘌呤堿基增多,，形成的醛基也隨之增多,，F(xiàn)eulgen反應(yīng)加強(qiáng)。如果水解時(shí)間過長(zhǎng),，DNA將*水解,，反而使Feulgen反應(yīng)減弱。DNA水解時(shí)間因組織種類和固定液不同而異,，需通過預(yù)實(shí)驗(yàn)找到合適的水解溫度和時(shí)間,。由于Schiff試劑能與醛基結(jié)合，故不能用含醛的固定液固定組織,，常用Carnoy固定液,。Bouin液不適用于Feulgen反應(yīng)，因?yàn)楣潭ㄒ褐泻^多的酸,，可將DNA水解,，影響染色反應(yīng)。
Schiff試劑是顯示醛基的特異試劑,，其反應(yīng)原理是堿性品紅(為紅紫色)經(jīng)亞硫酸處理后變?yōu)槲迳玈chiff液,，Schiff液遇到醛基時(shí),，則被還原形成原有的顏色，即紅紫色,。堿性品紅結(jié)構(gòu)中的醌基是堿性品紅中具有紫紅色的核心結(jié)構(gòu),，經(jīng)亞硫酸處理后，則醌基兩端的雙鍵打開,，形成五色品ii-硫酸復(fù)合物為Schiff試劑,。如果加熱使SO2逸出，則恢復(fù)品紅原來的顏色而失去對(duì)DNA的染色效果,，故配好的Schiff試劑應(yīng)避免SO2 逸出,。
Feulgen反應(yīng)原理
（二）Sohiff液的配制
將lg堿性品紅溶于200ml煮沸的蒸餾水中，使其*溶解,，然后冷卻到60℃過濾,。加入30ml 1N HCl和3g焦亞硫酸鉀(K：S：()；)或亞硫酸鈉,，塞緊瓶塞,，置于暗處或外包黑紙24小時(shí)。1N HCl與焦亞硫酸鹽生成的SO：將溶液中堿性品紅脫色成為無色堿性品紅(即白亞磺酸),。如溶液尚有淺黃色,，可用0．5g活性炭脫色，搖動(dòng)幾分鐘后迅速用粗濾紙過濾．濾液應(yīng)為清亮五色,。制成的Schiff試劑應(yīng)置于棕色瓶中，瓶塞需擰緊并用黑紙包裹,，避光保存于4℃,，保質(zhì)期可達(dá)半年。若暴露于空氣,，或加熱則使Schiff試劑中的S02 逸出,，變性的Schiff試劑則不能使用。除堿性品紅外,。其他堿性染料也可制成能與醛基反應(yīng)的類似Schie 反應(yīng)液,，但是。不能達(dá)到五色,。在染色時(shí)可用l％鹽酸乙醇洗去不起反應(yīng)的余色,。Schiff試劑在不同的pH條件下可顯示不同的物質(zhì)，如Sehiff試劑在pH 3．0～4．3時(shí),，對(duì)Feulgen反應(yīng)效果好,，而pH 2．4時(shí)，對(duì)PAS(糖原)反應(yīng)效果好,。
注意：Schiff試劑雖無色,，但氧化后為紫紅色,。同時(shí)要防止污染環(huán)境，用后要回收,。