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1.  基本概念通常，體外培養(yǎng)的生物成分無外乎兩種結(jié)構(gòu)形式：

其一是小塊組織或稱為組織塊（tissue block）,，一般稱為外植塊,；

其二是將生物組織分散后制成的單個細(xì)胞，一般稱為分離的細(xì)胞(isolated cell)或者分散的細(xì)胞(dissociated cell),。

分散的過程通常在培養(yǎng)液或平衡鹽溶液中進(jìn)行,，分散的細(xì)胞被懸浮于培養(yǎng)液或平衡鹽溶液中,。

單個細(xì)胞分散存在于培養(yǎng)液或其它平衡鹽溶液中、緩沖溶液中,，就稱為細(xì)胞懸液(cell suspension),。

狹義的細(xì)胞培養(yǎng)(cell culture)主要是指分離（散）細(xì)胞培養(yǎng)，廣義的細(xì)胞培養(yǎng)的概念還包括單（個）細(xì)胞培養(yǎng)(single cell culture),。一種是群體培養(yǎng)（mass culture）,，將含有一定數(shù)量細(xì)胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細(xì)胞貼壁生長,，匯合（confluence）后形成均勻的單細(xì)胞層,；另一種是克隆培養(yǎng)（clonal culture），將高度稀釋的游離細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中,，各個細(xì)胞貼壁后,，彼此距離較遠(yuǎn)，經(jīng)過生長增殖每一個細(xì)胞形成一個細(xì)胞集落,，稱為克?。╟lone）。一個細(xì)胞克隆中的所有細(xì)胞均來源于同一個祖先細(xì)胞,。

現(xiàn)今,，用于疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞基本有3類，即原代細(xì)胞,、二倍體細(xì)胞株及傳代細(xì)胞系,。經(jīng)過幾十年的研究和發(fā)展，目前我國已經(jīng)擁有了可以進(jìn)行大規(guī)模疫苗生產(chǎn)的動物原代細(xì)胞,、二倍體細(xì)胞和Vero細(xì)胞等生產(chǎn)技術(shù),，用于生產(chǎn)多種人用、動物疫苗,。其中二倍體細(xì)胞（如我國70年代建立的人胚肺二倍體細(xì)胞株KMB17和2BS）對多種病毒具有廣泛的敏感性,，用其制備病毒性疫苗可以克服使用原代細(xì)胞時在其培養(yǎng)物中可能存在的各種潛在致病因子的危險，是當(dāng)前病毒性疫苗生產(chǎn)較為理想的細(xì)胞基質(zhì),。Vero細(xì)胞是1962年由日本Chiba大學(xué)的Yasumura等人從成年非洲綠猴腎中分離獲得的,，是一種貼壁依賴性成纖維細(xì)胞，核型為2n 60,，高倍體率約為1.7%,，可持續(xù)地進(jìn)行培養(yǎng)，不含任何污染因子,。通常使用199培養(yǎng)基添加5%胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng),。該細(xì)胞可用于多種病毒的增殖，已被WHO批準(zhǔn)廣泛用于人用,、動物用疫苗生產(chǎn),。

2.  體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型

（一）貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長,，屬于貼壁依賴性細(xì)胞，大致分成以下四型：

（1）成纖維細(xì)胞型：胞體呈梭型或不規(guī)則三角形,，中央有卵圓形核,，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀,。除真正的成纖維細(xì)胞外,，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌,、平滑肌,、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài),。培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細(xì)胞,。

（2）上皮型細(xì)胞：細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核,，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜,。生長時呈膜狀移動，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連,，很少單獨行動,。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物,、消化管上皮,、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài),。

（3）游走細(xì)胞型：呈散在生長，一般不連成片,，胞質(zhì)常突起,，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則,。此型細(xì)胞不穩(wěn)定,，有時難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。

（4）多型細(xì)胞型：有一些細(xì)胞,，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài),，可統(tǒng)歸于此類。

（二）懸浮型:見于少數(shù)特殊的細(xì)胞,，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞,。胞體圓形，不貼于支持物上,，呈懸浮生長,。這類細(xì)胞容易大量繁殖,。

3.  培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程:體內(nèi)細(xì)胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶,、皿或其它容器,，生存空間和營養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后,，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液,，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代（Passage或Subculture）,。每次傳代以后,，細(xì)胞的生長和增殖過程都會受一定的影響。另外,，很多細(xì)胞在體外的生存也不是無限的,，存在著一個發(fā)展過程。所有這一切,，使組織細(xì)胞在培養(yǎng)中有著一系列與體內(nèi)不同的生存特點,。

（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期（Life Span of Culture Cells）:所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間,。體內(nèi)組織細(xì)胞的生存期與完整機體的死亡衰老基本相一致,。人胚二倍體成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，在不凍存和反復(fù)傳代條件下,，可傳30～50代,，相當(dāng)于150～300個細(xì)胞增殖周期，能維待一年左右的生存時間,，zui后衰老凋亡（Apoptosis）,。如供體為成體或衰老個體，則生存時間較短,；如培養(yǎng)的為其它細(xì)胞,如肝細(xì)胞或腎細(xì)胞,，生存時間更短，僅能傳幾代或十幾代,。只有當(dāng)細(xì)胞發(fā)生遺傳性改變,，如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時，細(xì)胞的生存期才可能發(fā)生改變,。正常細(xì)胞培養(yǎng)時,，不論細(xì)胞的種類和供體的年齡如何，在細(xì)胞全生存過程中,，大致都經(jīng)歷以下三個階段：

（1）原代培養(yǎng)（Primary Culture）期：也稱初代培養(yǎng),，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到*次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動,，可見細(xì)胞分裂,，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大,。細(xì)胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous）,，也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強,。

（2）傳代期：初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系（Cell Line）,。在全生命期中此期的持續(xù)時間zui長。在培養(yǎng)條件較好情況下,，細(xì)胞增殖旺盛,，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系（Diploid Cell Line）,。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì),，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當(dāng)前世界上常用細(xì)胞均在不出十代內(nèi)凍存,。如不凍存,，則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度，以利于生存,。但這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化,。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢,，以至*停止,，細(xì)胞進(jìn)入第三期。

（3）衰退期：此期細(xì)胞仍然生存,，但增殖很慢或不增殖,；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強，zui后衰退凋亡,。

在細(xì)胞生命期階段,，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點（多發(fā)生在傳代末或衰退期）,，由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（Spontaneous Transformation）,。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）,。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力,，這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系（Infinite Cell Line）,，也稱連續(xù)細(xì)胞系（Continuous Cell Line）。無限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末,，或第三期初階段,。細(xì)胞獲不死性后,，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā),，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì),。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。

（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期 所有體外培養(yǎng)細(xì)胞,，包括初代培養(yǎng)及各種細(xì)胞系,，當(dāng)生長達(dá)到一定密度后，都需做傳代處理,。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì),、接種細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞增殖速度等有關(guān)。接種細(xì)胞數(shù)量大,、細(xì)胞基數(shù)大,、相同增殖速度條件下，細(xì)胞數(shù)量增加與飽和速度相對要快（實際上細(xì)胞接種數(shù)量大時細(xì)胞增殖速度比時要快）,。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系比初代培養(yǎng)細(xì)胞增殖快,，培養(yǎng)液中血清含量多時細(xì)胞增殖比少時快。以上情況都會縮短傳代時間,。

所謂細(xì)胞“一代"一詞,，系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法,，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義,。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次,。它與細(xì)胞世代（Generation）或倍增〔Doubling〕不同,；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3～6次,。

細(xì)胞傳一代后,，一般要經(jīng)過以下三個階段：

（1） 潛伏期（Latent Phase）：細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期,。此時細(xì)胞胞質(zhì)回縮,，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上,，稱貼壁,，懸浮期結(jié)束。各種細(xì)胞貼附速度不同,，這與細(xì)胞的種類,、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞貼附慢，可長達(dá)10～24小時或更多,；連續(xù)細(xì)胞系和惡性細(xì)胞系快,，10～30分鐘即可貼附。細(xì)胞貼附現(xiàn)象是一個非常復(fù)雜和與多種因素相關(guān)的過程,。支持物能影響細(xì)胞的貼附,；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽性電荷利于貼附,。另外在貼附過程中,，有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素（Fibronectin），又稱LETS（Larger External Transformation Substance）,，細(xì)胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也參與貼附過程,。這些物質(zhì)都是蛋白類成分，它們有的存在于細(xì)胞膜的表面（如CSP）,，有的則來自培養(yǎng)基中的血清（LETS）,。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類細(xì)胞生長增殖條件之一,。

細(xì)胞貼附于支持物后,，除先經(jīng)過前述延展過程變成極性細(xì)胞，還要經(jīng)過一個潛伏階段,，才進(jìn)入生長和增殖期,。細(xì)胞處在潛伏期時，可有運動活動,，基本無增殖,，少見分裂相。細(xì)胞潛伏期與細(xì)胞接種密度,、細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān),。初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長，約24～96小時或更長,，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短,，僅6～24小時；細(xì)胞接種密度大時潛伏期短,。當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時,，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。

（2） 指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase）：這是細(xì)胞增值zui旺盛的階段,，細(xì)胞分裂相增多,。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂（Mitotic Index：MI）表示,，即細(xì)胞群中每1 000個細(xì)胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)受細(xì)胞種類、培養(yǎng)液成分,、pH,、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%,，初代細(xì)胞分裂指數(shù)低,，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%～5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動對細(xì)胞分裂指數(shù)有很大影響,。指數(shù)增生期是細(xì)胞一代中活力的時期,，因此是進(jìn)行各種實驗的和zui主要的階段。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下,，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后,，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少,、zui后細(xì)胞相互接觸匯合成片,。細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞,，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運動,，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（Contact Inhibition）。而惡性細(xì)胞則無接觸抑制現(xiàn)象,，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一,。腫瘤細(xì)胞由于無接觸抑制能繼續(xù)移動和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展,，使細(xì)胞發(fā)生堆積（Piled up）,。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制,，只要營養(yǎng)充分,，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多,。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大,，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時,，細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響,，則發(fā)生密度抑制（Density Inhibition），導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止,。因此細(xì)胞接觸抑制和密度抑制是兩個不同的概念,，不應(yīng)混淆。

（3） 停滯期（Stagnate Phase）：細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后,，細(xì)胞遂停止增殖,，進(jìn)入停滯期,。此時細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱平頂期（Plateau）,。停滯期細(xì)胞雖不增殖,，但仍有代謝活動，繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡,，代謝產(chǎn)物積累,、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代,，否則細(xì)胞會中毒,，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡,，故傳代應(yīng)越早越好,。傳代過晚（已有中毒跡象）能影響下一代細(xì)胞的機能狀態(tài)。在這種情況下,，雖進(jìn)行了傳代,，因細(xì)胞已受損，需要恢復(fù),，至少還要再傳1～2兩代,，通過換液淘汰掉死細(xì)胞和使受損輕微的細(xì)胞得以恢復(fù)后，才能再用,。結(jié)果反而耽誤了時間,，這是在實驗中應(yīng)特別注意的。

4.  原代培養(yǎng):即*次培養(yǎng),，是指將培養(yǎng)物放置在體外生長環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng),，中途不分割培養(yǎng)物的培養(yǎng)過程。有幾方面含義：

●培養(yǎng)物一經(jīng)接種到培養(yǎng)器皿（瓶）中就不在分割,，任其生長繁殖,；

●原代培養(yǎng)中的“代"并非細(xì)胞的“代"數(shù)，因為培養(yǎng)過程中細(xì)胞經(jīng)多次分裂已經(jīng)產(chǎn)生多代子細(xì)胞,；

●原代培養(yǎng)過程中不分割培養(yǎng)物不等于不更換培養(yǎng)液,，也不等于不更換培養(yǎng)器皿。

正常細(xì)胞培養(yǎng)的世代數(shù)有限,，只有癌細(xì)胞和發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞才能無限生長下去,。所謂轉(zhuǎn)化即是指正常細(xì)胞在某種因子的作用下發(fā)生突變而具有癌性的細(xì)胞。目前世界上許多實驗室所廣泛傳用的HeLa細(xì)胞系就是1951年從一位名叫Henrietta Lacks的婦女身上取下的宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)而成,。此細(xì)胞系一直延用至今,。

原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代左右就不易傳下去了，細(xì)胞的生長就會出現(xiàn)停滯,，大部分細(xì)胞衰老死亡,。但是有極少數(shù)的細(xì)胞能夠度過“危機"而繼續(xù)傳下去,，這些存活的細(xì)胞一般能夠傳到40～50代，這種傳代細(xì)胞叫做細(xì)胞株,。細(xì)胞株的遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生改變,在培養(yǎng)過程中其特征始終保持,。當(dāng)細(xì)胞株傳至50代以后又會出現(xiàn)“危機"，不能再傳下去,。但是有部分細(xì)胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變，并且?guī)в邪┳兊奶攸c,，有可能在培養(yǎng)條件下無限制地傳代下去,，這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞系。

原代培養(yǎng)是建立各種細(xì)胞系（株）必經(jīng)的階段,，其是否成功與組織污染與否,、供體年齡、培養(yǎng)技術(shù)和方法,、適宜培養(yǎng)基的選擇等多種因素有關(guān),。由于原代培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化性極小，對病毒敏感性好,，因此適應(yīng)制備疫苗等生物制品,；但也存在有潛在外源因子、不能事先檢查標(biāo)本,、且受供體年齡健康狀況的影響而導(dǎo)致批間差異大等缺陷,。目前常用的原代細(xì)胞培養(yǎng)有雞胚成纖維細(xì)胞及豬腎、猴腎,、地鼠腎等原代細(xì)胞,。

原代培養(yǎng)的基本過程包括取材、培養(yǎng)材料的制備,、接種,、加培養(yǎng)液、置培養(yǎng)條件下培養(yǎng)等步驟,，在所有的操作過程中,，都必須保持培養(yǎng)物及生長環(huán)境的無菌。

多數(shù)情況下,，分散的細(xì)胞若屬于貼壁依賴型細(xì)胞,，就能黏附、鋪展于培養(yǎng)器皿和載體表面生長而形成細(xì)胞單層,，這種培養(yǎng)方式稱為單層細(xì)胞培養(yǎng)（monolayer culture）,，又叫貼壁培養(yǎng)（adherent culture）。少數(shù)情況下,，培養(yǎng)的細(xì)胞沒有貼壁依賴性,，可通過專門設(shè)備使細(xì)胞始終處于懸狀態(tài)而在體外生長,，這種形式稱為懸浮培養(yǎng)（suspension culture）。如何讓接種的細(xì)胞盡快貼壁,，是決定培養(yǎng)成功的關(guān)鍵步驟：

●取決于適當(dāng)?shù)纳L基質(zhì)表面,；

●可降低接種后培養(yǎng)液對細(xì)胞的浮力，如先少補加少量培養(yǎng)液,，待細(xì)胞貼壁后再補足營養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),；

●注意適當(dāng)?shù)募?xì)胞接種密度，一般105個/ml左右,。

5.  傳代培養(yǎng)：當(dāng)原代培養(yǎng)成功以后,，隨著培養(yǎng)時間的延長和細(xì)胞不斷分裂，一則細(xì)胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制,，生長速度減慢甚至停止,；另一方面也會因營養(yǎng)物不足和代謝物積累而不利于生長或發(fā)生中毒。此時就需要將培養(yǎng)物分割成小的部分,，重新接種到另外的培養(yǎng)器皿（瓶）內(nèi),，再進(jìn)行培養(yǎng)。這個過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）,。對單層培養(yǎng)而言,，80%匯合或剛匯合的細(xì)胞是較理想的傳代階段。

體外培養(yǎng)技術(shù)中所謂的傳“代"概念并不等于細(xì)胞生物學(xué)中“親代細(xì)胞"與“子代細(xì)胞"中“代"的概念,。傳代培養(yǎng)的實質(zhì)就是分割后再一次培養(yǎng),，可以相對地衡量培養(yǎng)物的培養(yǎng)年齡。

6.   生長曲線：細(xì)胞接種入培養(yǎng)瓶后,，先進(jìn)入2-24h的延遲期（lag period）,，然后進(jìn)入指數(shù)生長期（即對數(shù)期）（log phase），匯合成單層進(jìn)入緩慢生長或停滯期（即平臺期）（plateau lhase）,。每種細(xì)胞系（cell line）的這些生長期（growth phase）都是特征性的,，只要環(huán)境條件保持恒定，每一次測定結(jié)果應(yīng)該是可重復(fù)的,。