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Caspase 3 活性測定（FIENA法）檢測細(xì)胞凋亡
點擊次數(shù)：939 發(fā)布時間：2014-12-29
Caspase3 的激活在凋亡過程的細(xì)胞事件啟動中起著重要作用,，有證據(jù)表明，在蛋白酶級聯(lián)切割過程中,，Caspase 3處于核心位置,。本法運用熒光酶聯(lián)免疫吸附法（flurometric immunosorbent enzyme assay， FIENA）的原理,， Caspase3激活后會作用于其特異的底物：乙?；於彼?谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酰胺（Ac-DEVD）,，如將Ac-DEVD與熒光素連接（Ac-DEVD-AFC），即會產(chǎn)生熒光裂解產(chǎn)物AFC,，而且caspase3的活性與Ac-DEVD-AFC的分解量或自由熒光產(chǎn)生熒光的強弱成正比,。本法可用于各種培養(yǎng)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)研究，而且靈敏度高,，特異性強（特異性的抗caspase 3單克隆抗體）,，與其他已知的caspases無交叉反應(yīng)。
材料與試劑
1. 20x包被緩沖液 ,；
2. 20x抗caspase3抗體,；
3. 封閉緩沖液；
4. 孵育緩沖液,；
5. 100xDTT,；
6. 20x底物Ac-DEVD-AFC；
7. AFC,；
8. 陽性對照： 凋亡細(xì)胞U937細(xì)胞裂解液,；
9. 微孔板。
操作步驟
1. 樣品制備： 以適當(dāng)方法誘導(dǎo)（如2x106 個細(xì)胞）凋亡（1-24小時）,。誘導(dǎo)后,，以冷PBS洗滌細(xì)胞并離心（300xg）5分鐘，收集細(xì)胞,。設(shè)置未經(jīng)誘導(dǎo)的陰性對照,；
2. 重懸細(xì)胞， 加入細(xì)胞裂解液與之作用,，冰上1分鐘,。 待細(xì)胞裂解后可以于-20°c儲存一周；或直接離心,，室溫1分鐘,，取細(xì)胞溶解液100μl用于測定；
3. 包板：用抗Caspase 3 抗體包被液包被微孔板,，孵育37℃ 1小時或4℃,。 用封閉緩沖液于室溫條件下作用30min，以封閉非特異性結(jié)合,。棄去封閉緩沖液,，并用孵育緩沖液洗三次；
4. 測定Caspase 3活性：將樣本（細(xì)胞裂解液100μl,、陰性對照,、陽性對照）加至抗caspase 3 包被MTP的微孔中，37℃孵育1小時,， 棄去未結(jié)合標(biāo)本,， 以孵育緩沖液于室溫洗板3 次,，每次1min。 加入新鮮配制的Caspase底物溶液,， 37℃ 反應(yīng)1~3小時,； 然后進行熒光光度檢測， 激發(fā)波長400nm,， 發(fā)射波長為505nm,。
結(jié)果判斷
Caspase 3的活性與AC-DEVD-AFC的分解量或自由熒光產(chǎn)生熒光的強弱成正比。
注意事項
此法特異性高,，可在106 細(xì)胞裂解物中檢測出5%的凋亡細(xì)胞率,。 然而，對特定樣本中的檢測下限則隨凋亡過程的動力學(xué),，誘導(dǎo)凋亡的試劑，以及在細(xì)胞總數(shù)中受影響的細(xì)胞數(shù)而異,。