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Hoechst-PI染色法檢測細(xì)胞凋亡
點(diǎn)擊次數(shù)：2350 發(fā)布時(shí)間：2014-12-15
亞“G1 ”峰方法簡便,，但只是代表G0 /G1 期發(fā)生凋亡的細(xì)胞，S期和G2 期細(xì)胞凋亡發(fā)生于G1 峰后,，無法觀察,。此外，由于全部細(xì)胞均經(jīng)固定,，因此不能區(qū)別死細(xì)胞和活細(xì)胞,。Hoechst-PI染色則可彌補(bǔ)上述不足。Hoechst 33258 可被活細(xì)胞攝取,，與DNA結(jié)合在紫外光下呈藍(lán)色熒光,。繼而PI使死細(xì)胞著染產(chǎn)生紅色熒光。因此在細(xì)胞二維直方圖上根據(jù)紅藍(lán)兩種熒光可分辨三種細(xì)胞：正?；罴?xì)胞對染料有拒染性,，藍(lán)色和紅色熒光均較少；凋亡細(xì)胞有膜通透性改變,，主要攝取Hoechst染料,，表現(xiàn)為強(qiáng)藍(lán)色熒光，弱紅色熒光,；壞死細(xì)胞由于有很強(qiáng)的PI嗜染性并可覆蓋Hoechest染色,，故呈弱藍(lán)色強(qiáng)紅色熒光。
【材料及試劑】
（1）碘化丙啶（PI）貯存液：100mg/ml,，4℃避光保存,。
（2）Hoechst 33258貯存液：100mg/ml,，4℃避光保存。
（3）0.01mol/L PBS pH 7.0~7.2
【操作步驟】
（1）常規(guī)制備單細(xì)胞懸液,；
（2）加入Hoechst 33258 溶液,，使其終濃度為1mg/ml，37 ℃水溶,，7分鐘,；
（3）冰上冷卻， 離心棄染液,， PBS重懸,；
（4）加入PI染液，使其終濃度為5mg/ml,，冰?。?/em>
（5）離心棄染液,，PBS洗一次,，進(jìn)行流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，,、直外激光檢測記錄400~500nm處藍(lán)色熒光和大于630nm處紅色熒光,；
【結(jié)果判斷】
正常對照細(xì)胞呈弱藍(lán)色及弱紅色熒光；凋亡細(xì)胞呈藍(lán)色及弱紅色熒光,，壞死細(xì)胞呈強(qiáng)紅色及弱藍(lán)色,。