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癌細胞的分離培養(yǎng)和接種
點擊次數(shù)：801 發(fā)布時間：2014-11-17
、組織塊——酒精浸泡——剪碎——Hank's沖洗——胰酶消化——離心——Hank's沖洗——離心——計數(shù)——轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶——37℃培養(yǎng)——接種,。
2,、組織塊——酒精浸泡——剪碎——轉(zhuǎn)至培養(yǎng)瓶——加培養(yǎng)液——37℃培養(yǎng)——接種。
具體操作步驟：
一、材料及試劑：
儀器：培養(yǎng)箱(調(diào)整至37℃),，培養(yǎng)瓶,、青霉素瓶、小玻璃漏斗,、平皿,、吸管、移液管,、紗布,、手術(shù)器械、血球計數(shù)板,、離心機,、水浴箱(37℃)。
材料：小鼠c26結(jié)腸癌和lewis肺癌組織塊,。
試劑：1640培養(yǎng)基(含20%小牛血清),，0.25%胰酶，Hank's液,，碘酒,。
二、操作步驟：
(一)胰酶消化法：
1,、器材：將小鼠c26結(jié)腸癌和lewis肺癌組織塊置75%酒精泡2-3秒鐘,。
2、用Hank's液洗滌三次,。
3,、用手術(shù)剪將組織剪成小塊(1mm2),，再用Hank's液洗三次,，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中。
4,、視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液,，37℃中消化20-40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次,，或用吸管吹打一次,，使細胞分離。
5,、加入3-5ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用(或加入胰酶抑制劑),。
6、靜置5-10分鐘,，使未分散的組織塊下沉,，取懸液加入到離心管中。
7,、1000rpm,，離心10分鐘,，棄上清液。
8,、加入Hank's液5ml,，沖散細胞，再離心一次,，棄上清液,。
9、加入培養(yǎng)液l-2ml(視細胞量),，血球計數(shù)板計數(shù),。
10、將細胞調(diào)整到5×105/ml左右,，轉(zhuǎn)移至25ml細胞培養(yǎng)瓶中,，37℃下培養(yǎng)。
上述消化分離的方法是zui基本的方法,，在該方法的基礎(chǔ)上,，可進一步分離不同細胞。細胞分離的方法各實驗室不同,，所采用的消化酶也不相同(如膠原酶,，透明質(zhì)酶等)。
(二)組織塊直接培養(yǎng)法：
自上方法第3步后,，將組織塊轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶,，貼附與瓶底面。翻轉(zhuǎn)瓶底朝上,，將培養(yǎng)液加至瓶中,，培養(yǎng)液勿接觸組織塊。入37℃靜置3-5小時,，輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,，使組織浸入培養(yǎng)液中(勿使組織漂起)，37℃繼續(xù)培養(yǎng),。
四,、注意事項：
1、自取材開始,，保持所有組織細胞處于無菌條件,。細胞計數(shù)可在有菌環(huán)境中進行。
2,、在超凈臺中,，組織細胞、培養(yǎng)液等不能暴露過久，以免溶液蒸發(fā),。
3,、凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞,，以防止細菌落入,。
五、無菌操作的幾個注意事項：
1,、操作前要洗手,，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試,。
2,、點燃酒精燈，操作在火焰附近進行,，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼,，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火,，并冷卻后才能夾取組織,，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜,。
3,、操作動作要準確敏捷，但又不能太快,，以防空氣流動,，增加污染機會。
4,、不能用手觸已消毒器皿的工作部分,，工作臺面上用品要布局合理。
5,、瓶子開口后要盡量保持45°斜位,。
6、吸溶液的吸管等不能混用,。
附：Hank's液配方：
KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g,，NaHCO3 0.35g,，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g,，Na2HPO4·H2O 0.06g,，加H2O至1000ml注：Hank's液可以高壓滅菌。4℃下保存。