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污染是細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中面臨的主要問(wèn)題,。某些污染的發(fā)生往往難以察覺(jué)檢測(cè),，而且污染源能長(zhǎng)期共存于培養(yǎng)體系中，這類染事實(shí)上大部分被人們忽視了,。

培養(yǎng)的細(xì)胞作為個(gè)生物體,，會(huì)對(duì)培養(yǎng)環(huán)境以及環(huán)境中的污染物作相應(yīng)的反應(yīng),，造成培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的改變，而實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成潛在的威脅,，而且隨著污染時(shí)間的長(zhǎng)而增加,。

培養(yǎng)環(huán)境中的物理、化學(xué)及生物因素都可能入培養(yǎng)環(huán)境造成污染,。由于入侵的微生物在培養(yǎng)系中不斷增殖,、代謝，因此生物性的污染對(duì)細(xì)胞的害zui大,。隨著污染微生物的不斷增殖,，交叉污染可能性也不斷增加。此外,，微生物代謝消耗大量需的養(yǎng)分,，同時(shí)產(chǎn)生多種有毒的代謝產(chǎn)物，如酶,、抗原及毒素等,，進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。因此,，識(shí)細(xì)胞培養(yǎng)污染的途徑及其危害性,，建立細(xì)胞培規(guī)范的操作方法及規(guī)章制度，可以有效地防止污染保證實(shí)驗(yàn)體系的穩(wěn)定性和可靠性,。

1 細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)

為了減少污染對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的影響,，必須建立細(xì)胞凍存庫(kù)。細(xì)胞凍存庫(kù)應(yīng)該分主細(xì)胞庫(kù)(Master cell bank,，MC和工作細(xì)胞庫(kù)(Working cell bank,，WC，當(dāng)需要做實(shí)驗(yàn)時(shí)從主細(xì)胞庫(kù)中復(fù)蘇細(xì)胞建立工作細(xì)胞庫(kù),。每一個(gè)凍存標(biāo)本都應(yīng)明確記錄細(xì)胞的性質(zhì),、代數(shù)及有無(wú)污染。同時(shí)還應(yīng)建立規(guī)范的檢測(cè)程序進(jìn)行菌檢及細(xì)胞鑒定,。

為了保證培養(yǎng)細(xì)胞系的完整性,，必須進(jìn)行詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)記錄，應(yīng)包括以下內(nèi)容:細(xì)胞系的種類及來(lái)源,、有無(wú)污染(如細(xì)菌,，病毒，支原體),、細(xì)胞代數(shù)和倍增時(shí)間,、以及選擇性突變。詳細(xì)的記錄有利于對(duì)細(xì)胞的遺傳及生理特性在常規(guī)傳代培養(yǎng)中因突變,、污染及各種原因?qū)е碌母淖冞M(jìn)行分析,。經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞與它較早代數(shù)的凍存細(xì)胞相比，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),，細(xì)胞在適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中,，其生物特性已發(fā)生了改變。培養(yǎng)的細(xì)胞由若干生長(zhǎng)速度及活力各異的亞群組成,。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)生長(zhǎng)速,，度快及活力高的細(xì)胞亞群逐漸占優(yōu)勢(shì)這種選擇性，趨勢(shì)會(huì)影響整個(gè)細(xì)胞群的生物特性,。應(yīng)用不同代數(shù)的細(xì)胞連續(xù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)則結(jié)果會(huì)發(fā)生偏差,。建立細(xì)胞凍存庫(kù)就能避免這種影響通過(guò)復(fù)蘇相同代數(shù)的細(xì)胞，人們就能在較為均一的條件下重復(fù)實(shí)驗(yàn),。

細(xì)胞培養(yǎng)工作需要清潔,，保持良好的環(huán)境及規(guī)范的操作程序。超凈工作臺(tái)是細(xì)胞培養(yǎng)中普遍使用的無(wú)菌操作裝置,，它需要合理的布置及經(jīng)常性的維護(hù),。超凈工作臺(tái)的工作原理是驅(qū)動(dòng)經(jīng)濾菌凈化后的空氣，通過(guò)工作臺(tái)面形成氣流屏障,，從而阻止外界污染物的侵入并使操作過(guò)程中產(chǎn)生的飛沫限制在超凈工作臺(tái)中,。因?yàn)椴僮鬟^(guò)程中可能產(chǎn)生有毒的物質(zhì)，所以采用垂直氣流比水平氣流安全,。

當(dāng)進(jìn)行移液,，傾倒液體的操作過(guò)程會(huì)產(chǎn)生飛沫并沉積在超凈工作臺(tái)內(nèi)物體的表面。超凈工作臺(tái)的氣流并不能阻止飛沫的產(chǎn)生,，飛沫會(huì)隨著氣流的方向飄浮,。超凈工作臺(tái)不合理的放置、不恰當(dāng)?shù)木S護(hù)以及不規(guī)范的使用會(huì)破壞超凈工作臺(tái)氣流的方向?qū)е嘛w沫更廣泛的沉積,。酒精燈的火焰,、操作者的活動(dòng)、談話,、咳嗽及打噴嚏都有可能影響氣流,。飛沫的沉積是導(dǎo)致超凈工作臺(tái)內(nèi)物品污染的主要因素造成潛在污染的進(jìn)一步傳播。因此為減少交叉污染的發(fā)生,，應(yīng)盡可能減少超凈工作臺(tái)內(nèi)的物品,。不同細(xì)胞系以及同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室不同操作者所使用的培養(yǎng)試劑一定要分開(kāi)使用，如胰酶,、培養(yǎng)液等,。否則，一個(gè)操作者的失誤可能引起所有細(xì)胞發(fā)生污染,。

2 細(xì)胞培養(yǎng)的污染

細(xì)胞培養(yǎng)污染是指培養(yǎng)環(huán)境中侵入了對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞變異的異物,。細(xì)胞培養(yǎng)污染可分為以下三類：物理性,、化學(xué)性及生物性。為了使細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果更可靠,，應(yīng)該固定所有培養(yǎng)條件,，并保證其重復(fù)性。

2.1 物理性污染的來(lái)源,、危害及預(yù)防

物理性污染常常被人們所忽視或被籠統(tǒng)地歸為化學(xué)性污染,。物理性污染通過(guò)影響細(xì)胞培養(yǎng)體系中的生化成分，從而影響細(xì)胞的代謝,。培養(yǎng)環(huán)境中的物理因素,，如溫度、放射線,、振動(dòng),、輻射(紫外線或熒光)會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響。細(xì)胞,、培養(yǎng)液或其它培養(yǎng)試劑暴露于放射線,、輻射或過(guò)冷過(guò)熱的溫度中，可以引起細(xì)胞代謝發(fā)生改變,，如細(xì)胞同步化,、細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制甚至細(xì)胞死亡。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室的合理設(shè)計(jì)及建立規(guī)范的操作規(guī)程,，可以減少環(huán)境中物理因素對(duì)細(xì)胞的影響,。孵箱應(yīng)放在溫度較恒定的環(huán)境中，周圍不能放置能引起機(jī)械振動(dòng)的設(shè)備,，如離心機(jī),。培養(yǎng)液及培養(yǎng)試劑應(yīng)放在固定的位置，為避免光照試劑不能放在玻璃門的冰箱中,，試劑周圍不能放同位素,。培養(yǎng)液從冰箱中取出后應(yīng)在室溫中放置一段時(shí)間后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以避免過(guò)冷的溫度對(duì)細(xì)胞的影響,。

2.2 化學(xué)性污染的來(lái)源,、危害及預(yù)防   

培養(yǎng)環(huán)境中許多化學(xué)物質(zhì)都可以引起細(xì)胞的污染?；瘜W(xué)物質(zhì)并不總是抑制細(xì)胞的生長(zhǎng),，某些化學(xué)物質(zhì)如激素就可促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。不同細(xì)胞對(duì)化學(xué)物質(zhì)污染的反應(yīng)是不一樣的,。未純化的物質(zhì),、試劑、水,、血清,、生長(zhǎng)輔助因子及儲(chǔ)存試劑的容器都可能成為化學(xué)性污染的來(lái)源,。細(xì)胞培養(yǎng)的必需養(yǎng)分，如氨基酸,，若濃度超過(guò)了合適的范圍,，也會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性,。同樣,，不同細(xì)胞系其*培養(yǎng)條件下對(duì)血清和緩沖液的要求是不一樣的，在培養(yǎng)中應(yīng)嚴(yán)格控制,。玻璃制品清洗過(guò)程中殘留的變性劑或肥皂(通常殘留在瓶蓋的內(nèi)表面)是zui常見(jiàn)的化學(xué)性污染,。

2.2.1 水 水是*一種在凝固時(shí)膨脹的化合物。因此在選擇凍存細(xì)胞的容器時(shí)應(yīng)考慮到這個(gè)因素,。容器因水的膨脹而發(fā)生破裂是引起試劑污染的重要原因,。為了避免金屬離子、有機(jī)分子,、細(xì)胞內(nèi)毒素等物質(zhì)對(duì)水的污染,，在配制液體，清洗容器時(shí)必須使用不含雜質(zhì)的超純水,。需要注意的是,，超純水放置過(guò)久其純度會(huì)下降。

在高壓蒸氣滅菌及蒸餾水時(shí)水經(jīng)常被污染,，因?yàn)楦邏赫魵忮伡凹兯畽C(jī)的常規(guī)維護(hù)后可能有少量的化學(xué)物質(zhì)殘留,。為了保證水的純度，我們應(yīng)采取措施盡量避免化學(xué)物質(zhì)的殘留,。

2.2.2 血清 動(dòng)物血清是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的天然培養(yǎng)基,，但血清又是潛在的生物及化學(xué)污染的來(lái)源。由于血清采集于多個(gè)動(dòng)物,，而且不同廠商的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量各不相同,，因此血清中許多成分的濃度存在很大的變異。血清對(duì)不同細(xì)胞的促生長(zhǎng)能力及毒副作用取決于這些細(xì)胞的分化功能,、組織來(lái)源及培養(yǎng)基的成分等因素,。在進(jìn)行一系列實(shí)驗(yàn)時(shí)，為了保證實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性,，選用同一批次的血清,。

2.2.3 培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分,、試劑 培養(yǎng)液,、培養(yǎng)附加成分、試劑都可能成為化學(xué)性污染的來(lái)源,。細(xì)胞培養(yǎng)使用的所有物質(zhì)都應(yīng)是高純度的,，并經(jīng)過(guò)機(jī)構(gòu)的鑒定,，實(shí)驗(yàn)者本人也應(yīng)對(duì)上述成分進(jìn)行純度鑒定。同時(shí),，正確配置和儲(chǔ)存培養(yǎng)液及試劑也是非常重要的,，應(yīng)該采取標(biāo)準(zhǔn)的操作步驟，避免液體體積計(jì)算錯(cuò)誤,，混用類似化合物等錯(cuò)誤,。

2.2.4 培養(yǎng)器皿及容器 細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)使用到各種不同的培養(yǎng)器皿及容器。培養(yǎng)器皿的大小,，構(gòu)形設(shè)計(jì)可能會(huì)影響到培養(yǎng)中氣體交換,、濕度、培養(yǎng)液的pH值和細(xì)胞生長(zhǎng)密度,。培養(yǎng)器皿的工藝及滅菌過(guò)程中的差異可能對(duì)培養(yǎng)體系產(chǎn)生影響,。塑料制品在生產(chǎn)過(guò)程中可能殘留一些有毒成形劑，生產(chǎn)工藝的不同可能引起器皿表面附著能力的不同,。儲(chǔ)存不同物質(zhì)時(shí)應(yīng)選用合適的塑料或玻璃容器,，因?yàn)榫凭?qiáng)酸,、強(qiáng)堿能夠溶解塑料或玻璃的某些成分,。

2.3 生物性污染的來(lái)源、危害及預(yù)防 外界的微生物如昆蟲(chóng),、節(jié)肢動(dòng)物,、原蟲(chóng)、霉菌,、病毒,、細(xì)菌、無(wú)細(xì)胞壁的微生物(通常指支原體)和其它類型的細(xì)胞都可能侵入培養(yǎng)環(huán)境引起污染,。只要在一個(gè)開(kāi)放的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng),，都難以避免發(fā)生污染。發(fā)生污染的可能性取決于操作方法,、培養(yǎng)室的無(wú)菌環(huán)境以及實(shí)驗(yàn)室的規(guī)章制度,。生物性污染對(duì)細(xì)胞代謝的影響，可因污染源和細(xì)胞的種類不同而表現(xiàn)各異,。細(xì)菌,、真菌或其它微生物污染的檢測(cè)可以用不同培養(yǎng)基進(jìn)行檢查。支原體污染的檢測(cè)需要特殊的方法,。病毒污染的檢測(cè)可以使用許多體內(nèi)或體外實(shí)驗(yàn),，包括大鼠或小鼠的接種、逆轉(zhuǎn)錄酶分析、凝血試驗(yàn),、紅細(xì)胞吸附試驗(yàn)等,。

細(xì)菌和真菌的污染較易發(fā)現(xiàn)并及時(shí)清除，而大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室對(duì)支原體的污染缺乏足夠的認(rèn)識(shí),。為了防止支原體及其它微生物污染的發(fā)生和傳播,，必須建立規(guī)范的無(wú)菌操作程序及各種規(guī)章制度。支原體歸屬

于柔膜體綱(Mollicutes)的支原體目,，它們都具有以下共性:無(wú)細(xì)胞壁,、無(wú)細(xì)胞壁主要成分———粘肽的表達(dá)。支原體與其它細(xì)菌不同之處還在于其胞膜中含有膽固醇或其它甾醇,，這種特性使支原體膜更具柔順性,，對(duì)于物理因素，如壓力,、滲透壓、脫水的抵抗力很3大,。支原體直徑僅有013～018μm,，并且變形能力大，故能通過(guò)濾菌器,。需要指出的是,，只要有一個(gè)具有增殖能力的支原體就能引起培養(yǎng)體系的污染。一旦細(xì)胞被污染,，支原體的滴度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高,，zui高可至每毫升10克隆。zui為致命的是,，即使存在很嚴(yán)重的支原體污染,，細(xì)胞外觀可無(wú)明顯變化。如果繼續(xù)使用這種已被支原體污染,，而貌似正常的細(xì)胞做實(shí)驗(yàn),，將會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.3.1 來(lái)源 培養(yǎng)體系中支原體污染的zui可能途徑是經(jīng)已被支原體污染的細(xì)胞擴(kuò)散和傳播,。細(xì)胞被支原體污染后,，支原體可以與宿主細(xì)胞形成一個(gè)共生體系，使污染不斷擴(kuò)大,。一旦發(fā)生支原體污染,，支原體和其它微生物會(huì)隨著飛沫而不斷傳播。操作過(guò)程中移液,，傾倒液體時(shí)都會(huì)產(chǎn)生具有潛在感染能力的飛沫,，并沉積在接觸到的表面。這種污染性飛沫能存活數(shù)天甚至數(shù)星期。此外,，操作失誤引起的交叉污染也是支原體污染的一個(gè)常見(jiàn)途徑,。人體的組織及體液成分是細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的主要來(lái)源。污染的細(xì)胞中通常能分離到人類口腔支原體,、發(fā)酵支原體,、唾液支原體以及其它一些與人有關(guān)的支原體，如M.buccale,，M.faucium,，M.homo2nis，M.pirum和生殖支原體等,。無(wú)菌操作過(guò)程中,，操作者能產(chǎn)生有污染性的隨空氣傳播的飛沫和微粒，造成培養(yǎng)體系的污染,。人體外周血,、骨髓、淋巴組織原代培養(yǎng)中有可能發(fā)生發(fā)酵支原體的原發(fā)污染(primarycontamination),，這也證明支原體在分化細(xì)胞中較未分化細(xì)胞更易生長(zhǎng),。隨著培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展，人們已能培養(yǎng)來(lái)自不同物種如動(dòng)物,、植物,、昆蟲(chóng)的各種細(xì)胞，同時(shí)也擴(kuò)大了支原體及其它微生物的宿主范圍,。此外,，某些支原體，如菜氏無(wú)膽甾原體科(Acholeplasmalaidlawii),、M.arginini,、M.hyorhinis、口腔支原體,、唾液支原體能寄生不同的宿主,，并能在培養(yǎng)體系中穩(wěn)定增殖數(shù)年。牛血清中能分離到A.laidlawii,、M.arginini和M.hyorhinis支原體,，因此血清可能成為支原體污染的來(lái)源。由于無(wú)血清培養(yǎng)基中許多附加成分及試劑是從血清或其它生物制品中制備的,，因此無(wú)血清培養(yǎng)體系并不能排除支原體污染的危險(xiǎn),。盡管隨著培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)步，血清發(fā)生污染的可能性進(jìn)一步降低,，但只要有一個(gè)活的支原體能通過(guò)濾菌器,，整個(gè)培養(yǎng)體系就會(huì)被污染。

2.3.2 危害 支原體通過(guò)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物及消耗各種養(yǎng)分，如核酸前體及必需氨基酸,，從而改變細(xì)胞的代謝狀態(tài),。支原體可以酵解糖，分解精氨酸,，氧化丙酮酸,，解脲支原體可以利用尿素作為能源，這會(huì)使細(xì)胞代謝發(fā)生一系列改變,，從而影響蛋白質(zhì),、DAN、RNA合成以及嘌呤從頭合成及補(bǔ)償合成途徑,。污染時(shí)間的長(zhǎng)短及核酸代謝改變決定了支原體污染造成的危害程度,，導(dǎo)致細(xì)胞染色體斷裂、重排,、非整倍體的出現(xiàn),。隨后，細(xì)胞的生長(zhǎng)特性發(fā)生改變,，使某些酶和細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加,，并表現(xiàn)出一些特殊的細(xì)胞功能，而其它一些細(xì)胞正常的功能則被抑制,。某些支原體附著在細(xì)胞表面后，會(huì)與宿主細(xì)胞交換膜抗原成分,。隨著細(xì)胞膜成分的改變,，細(xì)胞的形態(tài)及抗原性發(fā)生改變。細(xì)胞污染對(duì)研究工作帶來(lái)的zui大危害是由于錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果導(dǎo)致研究誤入歧途,。此外,，支原體污染還會(huì)干擾細(xì)胞的篩選，如雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制并喪失產(chǎn)生單抗的能力,。

2.3.3 預(yù)防及控制 污染發(fā)生后首先應(yīng)確定污染物的種類及污染的程度,。為了能正確檢測(cè)細(xì)菌或支原體的污染，應(yīng)先撤去培養(yǎng)液中的抗生素,。常規(guī)細(xì)胞傳代培養(yǎng)中應(yīng)用抗生素會(huì)導(dǎo)致:①掩蓋了不很嚴(yán)重的污染;②導(dǎo)致了耐藥菌的產(chǎn)生,。每一種抗生素的抗菌譜都是有限的，而且許多抗生素僅是抑制細(xì)菌生長(zhǎng),，而非殺菌劑,。因?yàn)橹гw無(wú)細(xì)胞壁，所以青霉素,，頭孢菌素等干擾細(xì)胞壁合成的抗生素對(duì)于支原體無(wú)效,。菌檢及支原體檢測(cè)只有在撤去抗生素后才能進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中若發(fā)生污染或其它問(wèn)題應(yīng)有詳細(xì)的記錄，并由經(jīng)驗(yàn)豐富的專家分析,，找出哪個(gè)環(huán)節(jié)出了問(wèn)題,，包括培養(yǎng)液的配置、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的保持和無(wú)菌操作過(guò)程等,，從而不斷完善操作規(guī)程,，避免類似問(wèn)題的現(xiàn)。此外,，管理者還應(yīng)制定細(xì)胞培養(yǎng)的各項(xiàng)規(guī)章制度,，教育每一個(gè)實(shí)驗(yàn)人員遵守。實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)人應(yīng)根據(jù)情況,，制定修改各項(xiàng)規(guī)范的操作程序及人員培訓(xùn)計(jì)劃,。一般來(lái)說(shuō)，隨著實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的擴(kuò)大,，細(xì)胞發(fā)生變異和污染的可能性增加了,。因此，大型實(shí)驗(yàn)室應(yīng)嚴(yán)格制定各項(xiàng)操作程序及規(guī)章制度,。細(xì)胞培養(yǎng)中無(wú)菌操作需要清潔的工作環(huán)境,、實(shí)驗(yàn)的合理安排、實(shí)驗(yàn)者熟練的操作技巧及強(qiáng)烈的責(zé)任感,。只有通過(guò)不斷地學(xué)習(xí),、訓(xùn)練，才能熟練掌握無(wú)菌操作技術(shù),。為了盡可能減少污染的發(fā)生,，以常規(guī)檢查的方式來(lái)監(jiān)督是必要的。細(xì)胞培養(yǎng)中發(fā)生污染是不可避免的,，我們的目的是盡可能減少污染的發(fā)生及危害,。

根據(jù)美國(guó)實(shí)驗(yàn)室的調(diào)查報(bào)告顯示，至少10%的細(xì)胞系存在支原體的污染,。一旦發(fā)生污染,，如果細(xì)胞有詳細(xì)的記錄，則污染引起的危害較小,。我們可以根據(jù)細(xì)胞定期菌檢記錄拼棄zui后一次細(xì)胞菌檢陰,，性后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。利用菌檢陰性的細(xì)胞重新開(kāi)始實(shí)驗(yàn),。如果僅偶爾進(jìn)行菌檢或采用非特異檢測(cè)方法,，尤其是支原體污染，那么確定污染的范圍比較困難,。因?yàn)樗械募?xì)胞系都有可能被交叉污染,。一旦發(fā)生污染,，所有未進(jìn)行菌檢的凍存細(xì)胞都必須進(jìn)行菌檢，以去除污染的細(xì)胞并明確污染發(fā)生的時(shí)間,。

2.3.4 檢測(cè) 由于支原體污染并不引起細(xì)胞外觀的明顯變化,，故常規(guī)的支原體檢測(cè)非常必要的。人們可利用一系列直接或間接的方法檢測(cè)支原體,。但由于支原體種類的多樣性,，目前還沒(méi)有一種方便、廣譜,、特異性高,、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。因此,，有必要對(duì)不同檢測(cè)方法的靈敏度及局限性有所了解,。

不同檢測(cè)方法對(duì)送檢標(biāo)本的要求不同，如果標(biāo)本不合格,，將不可能獲得正確的結(jié)果,。血清、培養(yǎng)液或培養(yǎng)基附加成分在加工和儲(chǔ)存過(guò)程中污染會(huì)在一6定程度上被稀釋,，影響檢出率,。間接檢測(cè)法由于其敏感性較差，若不采用濃縮標(biāo)本,，則不適用于檢測(cè)血清和培養(yǎng)液的污染,。由于污染物的隨機(jī)分布，因此僅進(jìn)行一次檢測(cè)通常會(huì)出現(xiàn)假陰性,。如果標(biāo)本中污染物濃度低于10個(gè)污染物/ml,，隨機(jī)抽取1ml標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)可能有366%的假陰性率。增加1標(biāo)本體積,，濃縮標(biāo)本有助于降低假陰性率。另一種假陰性的產(chǎn)生是由于污染物在試劑瓶,，凍存瓶等容器中的分布不均所致,。若20個(gè)樣品中有一個(gè)被污染(5%的污染率)，檢測(cè)所有20個(gè)樣品,，假陰率為,。需要指出的是僅僅單次檢測(cè)一個(gè)標(biāo)本來(lái)3616%，判斷有無(wú)生物性污染的作法是不可靠的,。因此,，在分裝液體前，就應(yīng)當(dāng)從原液中盡可能多取一點(diǎn)液體進(jìn)行檢測(cè),。如果不能做到這一點(diǎn),，則應(yīng)該用標(biāo)準(zhǔn)方法選擇多個(gè)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),。例如，在無(wú)菌過(guò)濾操作中,，隨著濾過(guò)體積的增大,，濾膜破損的可能性增加，故應(yīng)選擇zui后過(guò)濾的液體進(jìn)行檢測(cè),。

標(biāo)本的處理與標(biāo)本的選擇同樣重要,。各種酶如胰酶、脂酶,，強(qiáng)酸,，強(qiáng)堿或其它化學(xué)物質(zhì)會(huì)破壞支原體膜的脂質(zhì)，使支原體喪失活力及膜的完整性,。膜的完整性被破壞后,，支原體內(nèi)的蛋白酶及核酶釋放，從而會(huì)干擾間接檢測(cè)方法的結(jié)果,。如果標(biāo)本收集后不能當(dāng)天檢測(cè),，則應(yīng)該盡快凍存標(biāo)本以防止降解。

選擇,、處理檢測(cè)標(biāo)本的目的是盡可能發(fā)現(xiàn)潛在的污染,。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中就應(yīng)考慮到支原體污染的檢測(cè)。我們選用無(wú)抗生素培養(yǎng),，檢測(cè)應(yīng)盡可能離傳代時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn),，以便讓任何潛在的污染物生長(zhǎng)、繁殖,。為防止支原體活力喪失,，如果檢測(cè)的是貼壁細(xì)胞，應(yīng)采用刮除細(xì)胞的方法,，因?yàn)橐让富蚱渌蛛x方法會(huì)降低支原體的活性,。在選用合適的檢測(cè)方法時(shí)，應(yīng)考慮到支原體的滴度和活力這兩個(gè)因素,。直接培養(yǎng)法是zui敏感的,，但也是zui耗時(shí)的檢測(cè)方法，大約需28天,。從理論上講,，只需一個(gè)有活力的支原體就能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。但某些難以培養(yǎng)的支原體限制了直接培養(yǎng)法的應(yīng)用,。理想的直接培養(yǎng)法應(yīng)采用多功能的培養(yǎng)基,，以降低假陰7性率。為增加對(duì)低滴度和低活力支原體檢出率,，應(yīng)采用有氧和無(wú)氧兩種培養(yǎng)條件及幾種傳代方式,。直接培養(yǎng)法還需要活性支原體作為陽(yáng)性對(duì)照,，而且耗時(shí)，操作繁瑣,，因而不適于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室,。檢測(cè)支原體污染的間接法包括CR、ELISA,、電子顯微鏡檢查,、DNA探針、DNA熒光染色及生化7分析法等,。間接法能檢測(cè)到10/L的滴度,。通常情9況下，支原體污染后其滴度一般超過(guò)10/L,，故盡管間接法不敏感,，但相對(duì)較。由于支原體的多樣,，表達(dá)不同特異性的抗原及酶,，為生化及免疫檢測(cè)8法帶來(lái)技術(shù)上的困難。在選擇PCR,、DNA探針等方法前,，應(yīng)考慮好選擇合適的靶序列及引物序列。DNA熒光染色法和直接培養(yǎng)法相結(jié)合是支原5體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn),。美國(guó),、加拿大、日本和歐共體國(guó)家生物制藥及診斷的監(jiān)督機(jī)構(gòu)推薦使用這種方法,。其基本原理在于利用不同的技術(shù),，多次檢測(cè)，以彌補(bǔ)各種檢測(cè)技術(shù)的缺陷,，增加檢測(cè)結(jié)果的可信度,。

2.3.5 控制及排除 控制支原體污染或其它生物性污染的*可靠的方法是所有可能污染的物品用高壓蒸氣滅菌法消毒。所有細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備都應(yīng)消毒,，應(yīng)嚴(yán)格遵守上述的各項(xiàng)規(guī)章制度及監(jiān)督制度,，直至所有潛在的污染源都被消除。細(xì)胞一旦被支原體污染,，要將它清除是非常困難的。由于一些不可復(fù)得的細(xì)胞被污染,，人們不得不設(shè)法清除污染,，挽救一些珍貴的細(xì)胞。事實(shí)上,，經(jīng)支原體污染的細(xì)胞,，在污染經(jīng)處理被清除后,，細(xì)胞原有的許多生物學(xué)特性，如基因的表達(dá),，抗原性和代謝特點(diǎn)也隨之發(fā)生了相應(yīng)的改變,。排除支原體污染的方法，包括使用抗生素,、抗血清,、裸鼠體內(nèi)接種、巨噬細(xì)胞吞噬,、胰酶消化等方法,，但沒(méi)有一種方法是普遍有效的。所以在采用每一種方法時(shí)必須對(duì)其效果以及對(duì)細(xì)胞可能產(chǎn)生的毒性影響進(jìn)行監(jiān)測(cè),。Del6Guidice和Gardella提出了一個(gè)有效的方法,，其基本步驟包括首先分離、鑒定污染物及測(cè)定對(duì)抗生素的敏感性,，然后使用至少兩種敏感的抗生素進(jìn)行處理,。為增加排除污染的有效性，可以通過(guò)稀釋以降低血清及其它促生長(zhǎng)因子的濃度,，從而降低細(xì)胞的密度,。治療后細(xì)胞應(yīng)在無(wú)抗生素條件下培養(yǎng)若干代，以確定污染已被*清除,。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中支原體污染不易察覺(jué),，細(xì)胞被支原體污染后清除非常困難，支原體污染的細(xì)胞在支原體被清除后,，其細(xì)胞特性會(huì)發(fā)生很大改變,，對(duì)研究結(jié)果造成嚴(yán)重影響因此，為了保證細(xì)胞培養(yǎng)體系免受污染的影響,，關(guān)鍵是加強(qiáng)預(yù)防措施,。