QQ交談
您所在位置：請輸入產(chǎn)品關(guān)鍵字：
郵編：200431
聯(lián)系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機：13122441390 15900755943
留言：發(fā)送留言
個性化：www.shifengsj.com
網(wǎng)址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://sorrent.com.cn/st236594/
細胞損傷模型
點擊次數(shù)：973 發(fā)布時間：2014-10-16
體外肝細胞損傷模型建立（CCl4和H2O2）
1 ,、 大鼠肝細胞的分離和培養(yǎng)
大鼠4％戊巴比妥麻醉,，門靜脈插管，先以無鈣灌流液灌流,，繼以37℃通入O2的Ⅳ型膠原酶灌流液繼續(xù)循環(huán)灌流15 min,。將肝臟移至一平皿內(nèi)，輕輕撕去肝包膜后,，加入含5％小牛血清的清洗液,，用吸管吹打成單個肝細胞懸液,，200目尼龍網(wǎng)過濾,，低速離心（500 r·min-1，1 min,，4℃）棄上清,，同法用清洗液反復(fù)洗3次。然后用*1640培養(yǎng)液（內(nèi)含10％小牛血清，105 U·L-1青霉素,，100 mg·L-1鏈霉素和10 mg·L-1胰島素）制成1×109個·L-1肝細胞懸液,。分離的肝細胞經(jīng)0.6％臺盼藍拒染法測得細胞活力大于90％，高碘酸雪夫反應(yīng)顯示糖原法鑒定99％為肝實質(zhì)細胞,。
將上述肝細胞懸液分別加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培養(yǎng)板中,，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。12～16 h后可見肝細胞貼壁于培養(yǎng)板孔底上生長,。
2 、 CCl4誘導(dǎo)肝細胞壞死性損傷模型的建立
肝細胞培養(yǎng)12 h后,，吸棄上清,，更換培養(yǎng)液并加入不同濃度的CCl4〔（1～16 mmol·L-1），以少量的二甲亞砜助溶,，二甲亞砜終濃度為0.1％（體積分數(shù)）〕,，作用不同時間（1～12 h）后，收集24孔板中培養(yǎng)上清檢測AST,，以及肝細胞的MDA含量和GSHpx活性,；同步測定96孔板中培養(yǎng)肝細胞的MTT反應(yīng)。根據(jù)檢測結(jié)果制備CCl4誘導(dǎo)肝細胞損傷的量效和時效曲線,。選擇zui造損傷濃度和損傷時間制備肝細胞的損傷模型,，同時設(shè)溶媒對照組，每組至少設(shè)3個復(fù)孔,。
3 ,、 H2O2誘導(dǎo)肝細胞壞死性損傷模型的建立
同法更換培養(yǎng)液，加入不同濃度的H2O2（0.2～3.2 mmol·L-1）,，作用不同時間（0.5～4 h）后,，收集24孔板中培養(yǎng)上清檢測ALT，測定肝細胞的MDA含量,；同步測定96孔板中培養(yǎng)肝細胞的MTT反應(yīng),。根據(jù)檢測結(jié)果制備H2O2誘導(dǎo)肝細胞損傷的量效和時效曲線，選擇zui適損傷濃度和損傷時間制備肝細胞的損傷模型,，同時設(shè)溶媒對照組,，每組至少設(shè)3個復(fù)孔。
4 ,、 檢測指標
(1)AST,、ALT的測定 培養(yǎng)的肝細胞經(jīng)離心（1 800 r·min-1，10 min）后收集上清,，按試劑盒說明書步驟測定上清液中AST和(或)ALT活性,，結(jié)果以U·(106 cell)-1表示,。
(2)肝細胞增殖試驗 采用MTT比色法。
(3)肝細胞谷胱甘肽過氧化物酶（GSHpx）活性的測定 先制備GSH標準曲線,。棄肝細胞培養(yǎng)上清,，加入0.2％ Triton-100水溶液0.5 ml，混勻,，2 min后,，離心（2 500 r·min-1，10 min）,，取上清液（肝細胞樣品）0.4 ml,，另設(shè)樣品空白管，非酶反應(yīng)管和試劑空白管,，加入各種試劑,。混勻后立即計時,，靜置12 min后,，以樣品空白管調(diào)零點，于423 nm波長處讀得吸光度（A）值,。在GSH標準曲線上查出對應(yīng)的GSH波度,。GSHpx酶活力單位是在37℃，pH6.5條件下,，每106個肝細胞,、每分鐘使GSH濃度下降1 μmol為1個酶活力單位。計算公式為：GSHpx活力單位=（［GSH］非酶管-［GSH］樣品管-［GSH］試劑空白管）/3,。結(jié)果以U·(106 cell)-1表示,。
(4) 肝細胞丙二醛（MDA）含量的測定 先制備MDA標準曲線。棄肝細胞培養(yǎng)上清,，加入生理鹽水1 ml,，混勻，移入離心管中,，離心（2 500 r·min-1,，10 min），棄上清,，加15％ TCA 2 ml,，破壞細胞并沉淀蛋白質(zhì)，加入0.67％ TBA 2 ml,，于沸水浴中加熱30 min,。根據(jù)樣本的吸光度值在標準曲線上查出對應(yīng)的濃度，結(jié)果以 nmol·(106 cell)-1表示,。
5 ,、 數(shù)據(jù)處理
數(shù)據(jù)以±s表示，計量資料組間比較采用t檢驗,。兩變量間相互關(guān)系,，采用直線相關(guān)和回歸分析。