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士鋒生物細胞原代培養(yǎng)
點擊次數(shù)：1045 發(fā)布時間：2014-8-6
一、原理
將動物機體的各種組織從機體中取出,，經各種酶（常用胰蛋白酶）,、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞,，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，使細胞得以生存、生長和繁殖,，這一過程稱原代培養(yǎng),。
二、儀器,、材料及試劑
儀器：培養(yǎng)箱（調整至37℃）,，培養(yǎng)瓶、青霉素瓶,、小玻璃漏斗,、平皿、吸管,、移液管,、紗布、手術器械,、血球計數(shù)板,、離心機、水浴箱（37℃）
材料：胎鼠或新生鼠
試劑：1640培養(yǎng)基（含20%小牛血清）,，0.25%胰酶,，Hank’s液，碘酒
三,、操作步驟
（一）胰酶消化法
1,、器材：將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2—3秒鐘（時間不能過長,、以免酒精從口和肛門浸入體內）再用碘酒消毒腹部,，取胎鼠帶入超凈臺內（或將新生小鼠在超凈臺內）解剖取肝臟，置平皿中,。
2,、用Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪,，結締組織,，血液等雜物。
3,、用手術剪將肝臟剪成小塊（1mm2）,，再用Hank’s液洗三次,，轉移至小青霉素瓶中。
4,、視組織塊量加入5—6倍的0.25%胰酶液,，37℃中消化20—40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次,，或用吸管吹打一次,，使細胞分離。
5,、加入3—5ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）,。
6、靜置5—10分鐘,，使未分散的組織塊下沉,，取懸液加入到離心管中。
7,、1000rpm,，離心10分鐘，棄上清液,。
8,、加入Hank’s液5ml,，沖散細胞,，再離心一次，棄上清液,。
9,、加入培養(yǎng)液l—2 ml（視細胞量），血球計數(shù)板計數(shù),。
10,、將細胞調整到5×105/ml左右，轉移至25ml細胞培養(yǎng)瓶中,，37℃下培養(yǎng),。
上述消化分離的方法是zui基本的方法，在該方法的基礎上,，可進一步分離不同細胞,。細胞分離的方法各實驗室不同，所采用的消化酶也不相同（如膠原酶,，透明質酶等）,。
（二）組織塊直接培養(yǎng)法
自上方法第3步后，將組織塊轉移到培養(yǎng)瓶,，貼附與瓶底面,。翻轉瓶底朝上,，將培養(yǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸組織塊,。入37℃靜置3—5小時,，輕輕翻轉培養(yǎng)瓶，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起）,，37℃繼續(xù)培養(yǎng),。
四、注意事項
1,、自取材開始,，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數(shù)可在有菌環(huán)境中進行,。
2,、在超凈臺中，組織細胞,、培養(yǎng)液等不能暴露過久,，以免溶液蒸發(fā)。
3,、凡在超凈臺外操作的步驟,，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細菌落入,。
五,、無菌操作的幾個注意事項
1、操作前要洗手,，進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試,。試劑等瓶口也要擦試。
2,、點燃酒精燈,，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經常在火焰上燒灼,，金屬器械燒灼時間不能太長,，以免退火，并冷卻后才能夾取組織,，吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼,，以免燒焦形成碳膜。
3,、操作動作要準確敏捷,，但又不能太快，以防空氣流動，增加污染機會,。
4,、不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺面上用品要布局合理,。
5,、瓶子開口后要盡量保持45°斜位。
6,、吸溶液的吸管等不能混用,。
附：Hank’s液配方：
KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g,，NaHCO3 0.35g,，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g,，Na2HPO4·H2O 0.06g,，加H2O至 1000ml
注：Hank’s液可以高壓滅菌。4℃下保存,。