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士鋒生物瓊脂糖凝膠電泳實驗技巧
點擊次數：1027 發(fā)布時間：2014-6-19
核酸分子是兩性解離分子,，在高于其等電點的電泳緩沖液中,，其堿基不解離，而磷酸基團全部解離,，核酸分子因而帶負電荷,，電泳時向正極遷移。瓊脂糖主要從海洋植物瓊脂中提取而來并經糖基化修飾,，為一種聚合鏈線性分子,，使用瓊脂糖凝膠作為電泳支持介質，發(fā)揮分子篩功能,，使得大小和構象不同的核酸分子的遷移率出現(xiàn)較大差異,，從而達到分離的目的。瓊脂糖凝膠電泳操作簡單,、快速,，通過調整其使用濃度，使得分辨率達到大多數實驗的要求,，因此成為分離,、鑒定、純化核酸分子的常用方法,。但操作過程中仍有不少要注意的問題,。
1 凝膠制作
1．1 凝膠濃度 配制凝膠的濃度據實驗需要而變 ，一般在0．8％ ～2．0％之間,，如果一次配制凝膠100 ml,，沒用完的凝膠可以再次融化，但隨著融化次數的增加,，水分丟失也越多,，凝膠濃度則會越來越高,，導致實驗結果不穩(wěn)定，補水辦法：一是在容器上標記煮膠前的刻度,，煮膠后補充相應的水分至原刻度,；二是在煮膠前稱重，煮膠后補充水至原重量,。粗略一點的方法是通過多次較恒定的煮膠條件得出一個經驗補水值,。以保證凝膠濃度基本維持在原濃度。核酸染色劑溴化乙錠(ethidium bromide)可加在融化的瓊脂糖中,，終濃度為0．5 t*g／ml,；也可在電泳結束后染色。
1,、2 梳板的選用 一般每個制膠模具均配有多個齒型不同的梳板,，梳齒寬厚，形成的點樣孑L容積較大,，用于DNA 片段回收實驗等,；相反，梳齒窄而薄,，形成的點樣孑L容積就較小，用于PCR產物,、酶切產物鑒定等,。梳板的選擇主要是看上樣量的多少而定，一般來說,，上樣量小時盡量選擇薄的梳板制膠,，此時電泳條帶致密清晰，便于結果分析,。另外,，每次制膠時都要注意梳齒與底板的距離至少要1 mm，否則,，拔梳板時易損壞凝膠孑L底層,，導致點樣后樣品滲漏。當然,，點樣孑L的破壞還與拔梳板的時間和方法有關,，一般凝膠需冷卻30 min以上方可拔梳板，應急的情況下可以將成型的凝膠塊放4℃ 冰箱中冷卻15 min 左右,，拔梳板的方法是將制膠槽放置在電泳槽中的電泳緩沖液中,，然后垂直向上慢慢用力，因為有液體的潤滑作用,，梳板易拔出且不易損壞點樣孑L,。
2 點樣
點樣需加上樣緩沖液,，因為上樣緩沖液中加了甘油或蔗糖增加密度，使樣品沉入孑L底,；指示樣品的遷移過程,，上樣緩沖液中一般加了兩種指示劑，溴酚蘭和二甲苯青(值得注意的是指示劑并非染色劑,，DNA染色劑是溴化乙錠,，而且要在紫外光的激發(fā)下才能看見桔紅色熒光)。上樣緩沖液儲存液一般為6× (10×),，表示其濃度為工作濃度的六倍,。使用時上樣緩沖液應稀釋到一倍濃度。點樣方法是將移液器基本垂直點樣孑L,，用另一只手幫助固定移液器下端,，移液器槍頭(Tip)進入點樣孑L即可將樣品注入孑L內，千萬不可將Tip尖插至孑L底,，并點上適合的DNA分子量標準,，所謂適合是指樣品DNA分子量大小應基本在DNA分子量標準范圍之內。
3 電泳
將電泳儀的正極與電泳槽的正極相連,，負極與負極相連,，核酸帶負電荷，從負極向正極移動,。電泳槽中電泳緩沖液與制膠用電泳緩沖液應相同,，電泳緩沖液剛好沒過凝膠1 mm 為好，電泳緩沖液太多則電流加大,，凝膠發(fā)熱,。電泳時凝膠上所加電壓一般不超過5 v／cm(指的是正負電極之間的距離，而不是凝膠的長度),，電泳時間一般為3O～60 min,，根據實驗需要也可作適當調整，電壓增高,，電泳時間縮短,，核酸條帶相對來說不夠整齊，不夠清晰,；相反,，電壓降低，電泳時間較長,，核酸條帶整齊清晰,。另外，如果電泳后樣品泳動很慢或者沒泳動,，請檢查膠模兩端的封口膠條是否已去掉,。
4 結果分析
較成功的電泳結果是分子量標準條帶整齊清晰,，樣品條帶也整齊清晰，如果條帶模糊暗淡,，單從瓊脂糖凝膠電泳角度來說,，可能的原因：溴化乙錠的質和量怎樣?溴化乙錠見光易分解，母液配制時間過長或保存不當(一般4℃ 避光保存一年內有效),，或者終濃度沒達到0．5 vg／ml,；電泳槽中緩沖液使用次數過多，緩沖能力下降,。特別是TAE緩沖液,，一般用2～3次就要更換，TBE緩沖液則可使用10次左右,。
實際工作中經常發(fā)現(xiàn)DNA 分子量標準小片段模糊不清,，那足因為瓊脂糖凝膠濃度一般不會超過2 0％ ,，較小的核酸片段 在它的分辨范圍之內，并且EB帶正電荷,，電泳時會向負傲移動,，如果將凝膠置含EB(0．5#g／m1)的水溶液中30 min,，較小的片段則可重新染色：另外,，溴化乙錠(EB)是一種中等強度誘變劑,，操作過程中要戴手套，并將加有EB的染色液作好標記,、妥善保存 ,。。