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士鋒生物比色分析法和分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量
點(diǎn)擊次數(shù)：934 發(fā)布時(shí)間：2014-6-3
1. 掌握比色分析法和分光光度法基本原理、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及使用,，標(biāo)準(zhǔn)管法結(jié)果計(jì)算
2. 熟悉蛋白質(zhì)含量測(cè)定常用方法,、原理及應(yīng)用
3. 了解常用可見(jiàn)光、紫外分光光度計(jì)的測(cè)定原理及使用
【教學(xué)內(nèi)容】
1. 酚試劑法蛋白質(zhì)含量測(cè)定
Lambert-Beer定律,，比色分析法和分光光度法基本原理, 722型分光光度計(jì)使用,，常用蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法及應(yīng)用，酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量原理,、操作, 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及使用
2. 雙縮脲法蛋白質(zhì)含量測(cè)定
自學(xué)和獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)并與酚試劑法比較,，結(jié)果計(jì)算
3. 紫外分光光度法蛋白質(zhì)含量測(cè)定
紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量原理，方法,，優(yōu)缺點(diǎn),，注意事項(xiàng),；國(guó)產(chǎn)752型紫外分光光度計(jì)使用，UV—260分光光度計(jì)使用,，注意事項(xiàng),，波長(zhǎng)掃描，標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
【實(shí)驗(yàn)原理】
一,、比色分析法
許多物質(zhì)本身具有一定的顏色,，也有許多物質(zhì)本身無(wú)顏色，在加入適當(dāng)?shù)娘@色劑后生成有色物質(zhì),。溶液濃度越大,，顏色越深。因此可以利用比較溶液顏色深淺的方法來(lái)測(cè)定有色溶液的濃度,。這種方法叫比色分析法,。
比色分析法和分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量
←光的互補(bǔ)示意圖
1. 物質(zhì)的顏色和波長(zhǎng)：
可見(jiàn)光：波長(zhǎng)（λ）400—760nm
紫外光：λ小于400nm
紅外光：λ大于760nm
光的互補(bǔ)：將兩種適當(dāng)顏色的可見(jiàn)光按一定強(qiáng)度比例混合可得到白光，這兩種光叫互補(bǔ)光,，該現(xiàn)象叫光的互補(bǔ),。
單色光：白光通過(guò)棱鏡后可分解成各種波長(zhǎng)不同的色光，把具有一種波長(zhǎng),，不能再分解的光叫單色光,。
2. 溶液的顏色和光吸收的關(guān)系：
溶液的顏色，是由于不同的有色物質(zhì)有選擇地吸收某種顏色的光而引起的,。溶液呈現(xiàn)的顏色是與它主要吸收的光相互補(bǔ)的光的顏色,。溶液吸收的光越多，呈現(xiàn)的顏色越深,。
例如：一束白光通過(guò)核黃素溶液,，溶液呈黃色，是因?yàn)樗{(lán)色光被吸收,，而其它顏色的光均為兩兩互補(bǔ),，透過(guò)光只多余出黃色光，所以核黃素溶液呈黃色,。
光吸收曲線：測(cè)定同一物質(zhì)對(duì)不同波長(zhǎng)光線的吸收程度,，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)作圖,，所得曲線為光吸收曲線,。
3. 物質(zhì)濃度，液層厚度與光吸收的關(guān)系（Lambert--Beer定律）：
當(dāng)一束單色光通過(guò)溶液后,，光被溶液吸收的程度（D）與溶液的濃度（C）,，液層的厚（L）以及入射光的強(qiáng)度（I0）有關(guān)。溶液濃度越大,，液層越厚,，吸光越多，這就是物質(zhì)（均勻透明固體,，液體,，氣體）對(duì)光的吸收定律。
lg I0 / I 意義：
當(dāng)I = I0 時(shí),，lg I0 / I=0,，表示溶液*不吸收光線；
當(dāng)I＜I0時(shí),，lg I0 / I值較大,，表示溶液對(duì)光吸收較多；
當(dāng)I→0 時(shí),，lg I0 / I值無(wú)窮大,，表示光線幾乎被溶液*吸收（溶液不透光）。
由此可見(jiàn),，lg I0 / I表示了溶液對(duì)光的吸收程度,。
表示方法： 光密度OD或D（opticaldensity）
吸光度A（Absorbance）
消光度E（Extinction）
于是，(3)式可寫成：D = KCL
公式中K為消光系數(shù),，K = D/CL,，表示有色溶液在單位濃度和單位厚度時(shí)的吸光度。
同一溶質(zhì),，K值相同,。
百分消光系數(shù)：C = 1%，L = 1cm
克分子消光系數(shù)：C = 1克分子濃度,，L=1cm
D=KCL意義：物質(zhì)對(duì)光吸收程度與該物質(zhì)的消光系數(shù)K,，溶液濃度C，液層厚度L成正比,。