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士鋒生物凝膠層析法脫鹽和分離蛋白質
點擊次數：858 發(fā)布時間：2014-5-15
（一）原理
凡鹽析所獲得的粗制蛋白質（鹽析得到的IgG）中均含有硫酸銨等鹽類,，這類將影響以后的純化，所以純化前均應除去,，此過程稱為“脫鹽”（desalthing）,。脫鹽常用透析法和凝膠過濾法，這兩種方法各有利弊,。前者的優(yōu)點是透析后析品終體積較小,，但所需時間較長，且鹽不易除盡,；凝膠過濾法則能將鹽除盡，所需時間也短,，但其凝膠過濾后樣品體積較大。所以,，要根據具體情況選擇使用,。前實驗中樣品體積較小,，凝膠達濾后樣品體積不會太增加,，所以選用凝膠過濾法,。
（二）試劑與器材
（1）Sephadex G-25。
（2）0.0175mol/L,，pH6.7磷酸鹽緩沖液。
（3）奈氏（Nessler）試劑：于500ml錐形瓶內加入碘化鉀150g,，碘110g,，汞150g及蒸餾水100ml,。用力振蕩7～15min,，至碘的棕色開始轉變時,，混合液溫度升高,，將此瓶浸于冷水內繼續(xù)振蕩,，直到棕色的碘轉變?yōu)閹ЬG色的碘化鉀汞液為止。將上清液傾入2000ml量筒內,，加蒸餾水至2000ml，混勻備用,。
（4）20%（W/V）磺基水楊酸溶液,。
（5）1.5cm×20cm層析柱。
（6）黑,、白比色磁盤。
（三）操作
（1）取層析柱1支（1.5cm×20cm）,，垂直固定在支架上,，關閉下端出口。將已經溶脹好的Sephadex G-25中的水傾倒出去,，加入2倍體積的0.0175mol/L，pH6.7磷酸鹽緩沖液,，并攪拌成懸浮液，然后灌注入柱,，打開柱的下端出口，繼續(xù)加入攪勻的Sephadex G-25,，使凝膠自然沉降高度到17cm左右,，關閉出口,。待凝膠柱形成后，在洗脫瓶中加入0.0175mol/L,，pH6.7磷酸鹽緩沖液以3倍柱體積的磷酸鹽緩沖流過凝膠柱,，以平衡凝膠。
（2）凝膠平衡后,，用皮頭滴管除去凝膠柱面的溶液，將鹽析所得全部IgG樣品加到凝膠柱表面,，打開柱下口,，控制流速讓IgG樣品溶液慢慢浸入凝膠內。凝膠柱面上加一層的0.0175mol/L,，pH6.7磷酸鹽緩沖液，并用此緩沖液洗脫,，控制流速為0.5ml/min左右,。用試管收集洗脫液,，每管10滴。
（3）在開始收集洗脫液的同時檢查蛋白質是否已開始流出,。為此,，由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盤中,，加入1滴20%磺基水楊酸，若呈現白色絮狀沉淀即證明已有蛋白質出現,，直到檢查不出白色沉淀時，停止收集洗脫液,。
（4）由經檢查含有蛋白質的每管中，取1滴溶液,，放置在白色比色盤孔中，加入1滴奈氏試劑,，若呈現棕黃色沉淀說明它含有硫酸銨,。合并檢查后不含硫酸銨的各管收集液,，即為“脫鹽”后的IgG。
注意：在檢測時,，用皮頭滴管吸取管中溶液后應及時洗凈,，再吸取下一管,，以免造成相互污染假象,。
附：凝膠過濾法原理及基本操作
1．原 理
凝膠過濾（gel filtration）,，又稱為凝膠層析（gel chromatography）,、分子篩過濾（molecular sieve filtration）,、凝膠滲透層析（gel osmotic chromatography）等,。它是20世紀60年代發(fā)展起來的一種層析技術。其基本原理是利用被分離物質分子大小不同及固定相（凝膠）具有分子篩的特點,，將被分離物質各成分按分子大小分開,，達到分離的方法。
凝膠是由膠體粒子構成的立體網狀結構,。網眼里吸滿水后凝膠膨脹呈柔軟而富于彈性的半固體狀態(tài),。人工合成的凝膠網眼較均勻地分布在凝膠顆粒上有如篩眼，小于篩眼的物質分子均可通過,，大于篩眼的物質分子則不能，故稱為“分子篩”,。凝膠之所以能將不同分子的物質分開是因為當被分離物質的各成分通過凝膠時，小于篩眼的分子將*滲入凝膠網眼,，并隨著流動相的移動沿凝膠網眼孔道移動，從一個顆粒的網眼流出,，又進入另一顆粒的網眼,，如此連續(xù)下去,，直到流過整個凝膠柱為止,，因而流程長、阻力大,、流速慢；大于篩眼的分子則*被篩眼排阻而不能進入凝膠網眼,，只能隨流動相沿凝膠顆粒的間隙流動,，其流程短,、阻力小,、流速快，比小分子先流出層析柱,；小分子zui后流出,。分子大小介于*排阻不能進入或*滲入凝膠篩眼之間的物質分子,，則居中流出,。這樣被分離物質即被按分子的大小分開,。
用于凝膠層析的凝膠均為人工合成的產品,，主要有交聯葡聚糖（商品名為Sephadex）、瓊脂糖（商品名為Sepharose）,、聚丙烯酰胺凝膠（商品名為Bio–gel）及具有一定網眼的細玻璃珠等和這些凝膠的衍生物。
下面主要介紹葡聚糖凝膠,，這是由葡萄糖的多聚物與1–氯– 2,、3–環(huán)氧丙烷交連而成。環(huán)氧丙烷引入丙三醇基將鏈狀的多聚葡萄糖單位交聯起來,，凝膠網眼的大小由多聚葡萄糖的分子和環(huán)氧丙烷的比例（交聯度）來控制。