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士鋒生物葡聚糖凝膠層析脫鹽
點擊次數：1376 發(fā)布時間：2014-5-14
凝膠層析又稱凝膠過濾或排阻層析,。凝膠過濾的主要裝置是填充有層析介質的層析柱,。
1. 層析介質的特點
（1）遇水為不溶解的固相； （2）是化學惰性物質,；
（3）離子基團含量少,； （4）顆粒大小和網眼均勻,；
（5）機械強度較強； （6）具有可選擇的多種孔徑,。
目前使用較多的是葡聚糖凝膠,、聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠及其衍生物,。尤其葡聚糖凝膠（商品名稱Sephadex）是zui常用的層析介質,。它是由一定平均分子量的葡聚糖和交聯劑1-氯-2,3-環(huán)氧丙烷（葡聚糖凝膠層析脫鹽 ）交聯成的具有三維結構不溶于水的高分子化合物。調節(jié)葡聚糖和交聯劑配比,，可以獲得網眼大小不同,，型號各異的凝膠。當葡聚糖分子量越小,，交聯劑用量越大,，則交聯度越大，凝膠網眼越小,，吸水量越小,，G值也越小。G值表示每克干膠吸水量（mL）的十倍,。例如Sephadex G-25其吸水量應為2.5mL/g干膠,。常用的葡聚糖凝膠有多種規(guī)格，如G-10,、G-15,、G-25、G-50,、G-75,、G-100等。實驗中選用何種型號應根據被分離的混合物分子的大小及工作目的來確定（參見附錄五）,。
2. 分離原理
當混合樣液加到凝膠柱上,，隨著洗脫劑而通過凝膠柱時，分子大小不同的物質受到不同的阻滯作用,。顆粒接近或大于網眼的分子,，不能進入凝膠的網眼中，在重力作用下它們隨著溶劑在凝膠顆粒之間沿較短流程向下流動,，受到的阻滯作用小,，移動速度快，先出層析柱（此現象叫作被排阻,。被排阻的zui小分子量稱為該規(guī)格凝膠的排阻極限）,；而顆粒小于網眼的分子可滲入凝膠網眼之中，它們被洗脫時不斷地從一個網眼穿到另一個網眼，逐層擴散,，阻滯作用大,，流程長，移動速度慢,，因而后出層析柱,。在層析柱的出口處，我們用多個試管分步收集洗脫液,，就可將混合物中各組分彼此分離,。
當我們從生物組織中用鹽析法提取蛋白質后，常需要進行蛋白質的脫鹽工作,，我們可采用層析介質為葡聚糖凝膠G-25（或G-15,、G-50），用適當的洗脫劑進行洗脫,，經凝膠層析,，就可以將大分子蛋白質與小分子鹽類分離。
三. 實驗材料及設備
1. 材料
含硫酸銨鹽的蛋白質溶液
2. 器材
層 析 柱： 內徑×柱高=1.0cm×25cm
滴定臺架,、螺絲夾：各1
刻度試管： 10mL×14
移 液 管： 1mL×1
燒 杯： 250mL×1 50mL×1
滴 管： 2
洗 耳 球： 2
洗瓶,、試管架、移液管架,、玻棒：各1
四. 試劑的配制
1. 葡聚糖凝膠Ｇ-25(或G-15,、G-50)
溶脹凝膠方法：按每個層析柱約4g的量稱取葡聚糖凝膠G-25于燒杯中，加過量蒸餾水于沸水浴中溶脹2小時或在室溫下溶脹6小時以上,。用傾瀉法除去上層漂浮的細碎凝膠,，重復3～4次。操作中避免劇烈攪拌,，防止破壞其交聯結構,。
2. BaCl2溶液（1%）
3. 考馬斯亮藍G-250
稱取0.1g考馬斯亮藍G-250，先溶于50mL95%乙醇中,，再加入85%的磷酸100mL,，zui后用蒸餾水定容到1000mL。暗處存放,。
4. 脲（6mol/L）
5. 洗脫劑
應依據被純化的蛋白質的不同特性而選用不同的緩沖液,。