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士鋒生物生物大分子的基本制備技術(shù)
點(diǎn)擊次數(shù)：904 發(fā)布時(shí)間：2014-4-28
生物大分子的制備過(guò)程包括選材,、細(xì)胞破碎和細(xì)胞器分離、生物大分子提取純化、以及樣品濃縮干燥和儲(chǔ)存等,。
生物大分子的制備是一項(xiàng)十分細(xì)致的工作,，既要設(shè)法得到它們的純品,，又要努力保持其生物活性,。有時(shí)制備一個(gè)純度較高的蛋白質(zhì)、酶或核酸,，需要付出較長(zhǎng)時(shí)間的艱苦勞動(dòng),。
生物大分子制備方法的選擇是以生物大分子的理化性質(zhì)為依據(jù)的（表1-1）。
對(duì)于理化性質(zhì)不同的生物大分子,，所選用的分離提純方法也不相同,。
表1-1 生物大分子的理化性質(zhì)與分離純化方法的選擇
在生物大分子的制備過(guò)程中，為隨時(shí)了解所用方法和條件的效果,，以及提取物質(zhì)的純度和得率,，必須對(duì)所提取的生物大分子進(jìn)行追蹤分析鑒定。因此在提純以前,，必須建立對(duì)所提取生物大分子相應(yīng)的分析鑒定方法,。
以蛋白質(zhì)的分離純化過(guò)程為例，在分離,、純化過(guò)程中,，每進(jìn)行一個(gè)步驟都需對(duì)所得樣品的比活性（總活性/總蛋白）、得率（每一步驟總活性與*步總活性的百分比,，設(shè)開(kāi)始時(shí)的總活性為100%）和提純倍數(shù)（每一步驟比活性與*步比活性的比值,，設(shè)開(kāi)始時(shí)為1）進(jìn)行測(cè)定。一般認(rèn)為所得樣品的比活性和得率越高以及純化倍數(shù)越大則效果越好,。但實(shí)際應(yīng)用中往往須考慮多方面的因素來(lái)選擇和確定提純方法及步驟,，如對(duì)提純樣品純度和活性的要求、原材料的來(lái)源,、實(shí)驗(yàn)條件以及所用材料的價(jià)格等都是我們要考慮的,。
下面是從豬肝中提純異檬酸脫氫酶的過(guò)程。該提取過(guò)程有六個(gè)步驟,，現(xiàn)將每一步驟所得樣品的比活性,、得率和純化倍數(shù)等追蹤測(cè)定結(jié)果列于表1-2。據(jù)此結(jié)果可判斷每一步驟的提純效果,。
從表1-2可知豬肝異檸檬酸脫酶被提純570倍,，得率是25.5%。
本章僅以蛋白質(zhì)分離純化為例,，對(duì)一些基本技術(shù)進(jìn)行介紹,。電泳、層析,、 離心技術(shù)等將在專(zhuān)門(mén)章節(jié)給予介紹,。
一,、鹽析（Salting out）
鹽析方法是蛋白質(zhì)和酶提純工作中應(yīng)用zui早，至今仍廣泛應(yīng)用的方法,。其原理是蛋白質(zhì)在高濃度的鹽溶液中,，隨著鹽濃度的逐漸增加，蛋白質(zhì)表面的電荷被中和,，水化膜被破壞,，蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中沉淀析出。鹽析法就是根據(jù)各種蛋白質(zhì)在一定濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達(dá)到彼此分離的方法,。
在鹽析時(shí),，蛋白質(zhì)的溶解度與溶液中離子強(qiáng)度（見(jiàn)第四章電泳）的關(guān)系可用下式表示：
生物大分子的基本制備技術(shù)
式中S0是蛋白質(zhì)在純水（離子強(qiáng)度I=0）中的溶解度，S為蛋白質(zhì)在離子強(qiáng)度為I的溶液中的溶解度,，KS為鹽析常數(shù),。