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聚丙烯酰胺凝膠平板等電聚焦電泳測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)
點(diǎn)擊次數(shù)：1574 發(fā)布時(shí)間：2014-4-25
等電點(diǎn)聚焦（isoelectric focusing, IEF）或簡(jiǎn)稱電聚焦（electrofocusing）,，也曾稱等電點(diǎn)分離聚焦電泳等,。它是60年代中期出現(xiàn)的技術(shù),，克服了一般電泳易擴(kuò)散的缺點(diǎn),。近年來(lái),，等電點(diǎn)聚焦電泳又有了新的進(jìn)展，可以分辨等電點(diǎn)只差0.001pH單位的生物分子,。由于它的分辨力高,、重復(fù)性好,、樣品容量大,、操作簡(jiǎn)便,、迅速,，在生物化學(xué)、分類學(xué),、分子生物學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)研究等諸方面,，都得到廣泛應(yīng)用。
等電點(diǎn)聚焦電泳產(chǎn)生pH梯度的方法有兩種：一是用兩種不同的pH緩沖液相互擴(kuò)散,，在混合區(qū)形成pH梯度,，此為人工pH梯度。這種pH梯度不穩(wěn)定,，常用于制備電泳,；另一種是利用載體兩性電解質(zhì)在電場(chǎng)作用下形成自然pH梯度。本實(shí)驗(yàn)就是利用載體兩性電解質(zhì)形成的自然pH梯度進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品等電焦聚電泳的,。
理想的載體兩性電解質(zhì)應(yīng)該在其本身的等電點(diǎn)處有足夠的緩沖能力和良好的導(dǎo)電性,，且分子量要小,，組成與被分析樣品有所區(qū)別，對(duì)分析樣品無(wú)變性作用或發(fā)生化學(xué)反應(yīng),。常用的載體兩性電解質(zhì)是一系列脂肪族多氨基和多羧基類的混合物,，即是一系列的異構(gòu)物和同系物，分子量在300—1000之間,，各組分的等電點(diǎn)(pI)既有差異又相接近,，pI的范圍在2.5—11之間。合成載體兩性電解質(zhì)的原料是丙烯酸和多乙烯多胺,，合成反應(yīng)如下：
聚丙烯酰胺凝膠平板等電聚焦電泳測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)
R1和R2為氫或帶有氨基的脂肪基,。這一反應(yīng)的特點(diǎn)是生成眾多的異構(gòu)物和同系物的混合物，而不是均一的化合物,?；旌衔镏懈鞒煞值暮俊⒌入婞c(diǎn)的分布,，取決于原材料的性質(zhì),、比例和合成條件。目前常用的載體兩性電解質(zhì)的商品有：Ampholine（LKB公司）,、Pharmlyte（Pharmacia公司）,、Serralyty（Serva公司），近來(lái)已有國(guó)產(chǎn)商品了,。不同廠家合成的方法不同,，電泳的條件也略有不同。目前,，載體兩性電解質(zhì)商品在使用時(shí)還存在一些問(wèn)題,，如樣品中的鹽濃度對(duì)pH梯度有影響等，但畢竟優(yōu)點(diǎn)很多,，仍然得到廣泛應(yīng)用,。
分析載體兩性電解質(zhì)的結(jié)構(gòu)可知,，它既有酸性基團(tuán)(—NH3+ ),，也有堿性基團(tuán)(—COO- )，既可接受分子,，也可釋放質(zhì)子：
聚丙烯酰胺凝膠平板等電聚焦電泳測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)
它們?cè)谒嵝詶l件下帶正電荷,，在堿性條件下帶負(fù)電荷。當(dāng)它們所帶的正負(fù)電荷相等時(shí),，其凈電荷為零,，呈電中性，此時(shí)溶液的pH值為該兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn),，以pI表示,。所以兩性電解質(zhì)的等電點(diǎn)在數(shù)值上等于它呈電中性時(shí)溶液的pH值,。等電點(diǎn)是反映兩性電解質(zhì)在溶液中得失質(zhì)子的能力，是它的物化性質(zhì),。兩性電解質(zhì)在溶液中的行為可以從兩方面看,，一方面溶液的pH決定它帶電荷的性質(zhì)。如溶液是pH7,，對(duì)pI=9的兩性電解質(zhì)來(lái)說(shuō),，是處于酸性環(huán)境，故帶正電荷,；但對(duì)pI=3的兩性電解質(zhì)來(lái)說(shuō),，卻是處于堿性環(huán)境，故而帶負(fù)電荷,。所以,，不同pI的兩性電解質(zhì)，在同一環(huán)境中帶有不同性質(zhì)和數(shù)量的電荷,；另一方面,，溶液中的兩性電解質(zhì)又破壞了水的解離平衡：
聚丙烯酰胺凝膠平板等電聚焦電泳測(cè)定蛋白質(zhì)等電點(diǎn)使溶液pH有所改變。當(dāng)某一兩性電解質(zhì)pI較低,，即釋放質(zhì)子（H+）能力較強(qiáng),，使溶液pH值下降，這類兩性電解質(zhì)稱為酸性兩性電解質(zhì),；反之,，pI高的可使溶液pH值上升，稱為堿性兩性電解質(zhì),。所以,，在溶液中的兩性電解質(zhì)一方面受溶液pH值的影響，決定其帶電的性質(zhì),；另一方面,，它又影響周圍環(huán)境（水溶液），使其pH值有所改變,。