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士鋒生物細(xì)胞的原位雜交技術(shù)
點(diǎn)擊次數(shù)：866 發(fā)布時(shí)間：2014-4-23
原位雜交(ISH)是一種可在細(xì)胞涂片、組織切片以及分裂中期染色體帶中檢測(cè)DNA或RNA的技術(shù),，此方法原理是由DNA或RNA的序列與互補(bǔ)的標(biāo)記單鏈DNA/RNA探針結(jié)合形成標(biāo)記的雙鏈雜交分子,，本技術(shù)可對(duì)組織細(xì)胞原位的待測(cè)核酸分子進(jìn)行定性，定量及定位分析,。在細(xì)胞分化調(diào)節(jié),、基因定位、腫瘤遺傳學(xué),、分子病理學(xué),、病毒學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。經(jīng)典的原位雜交技術(shù)包括載玻片處理,，組織細(xì)胞的固定,，探針的制備或選購(gòu)，原位雜交,，洗滌以及檢測(cè)，其中探針制備技術(shù)不屬于本章專業(yè)技術(shù),，故不作具體評(píng)敘,，略交待制備使用原則。本章節(jié)主要介紹培養(yǎng)細(xì)胞的原位雜交技術(shù),。
一,、探針的制備原則和選擇
探針為RNA或雙鏈、單鏈DNA,，雙鏈探針較單鏈探針有很多缺點(diǎn),，探針必須變性、復(fù)性，降低了探針雜交效率,，雙鏈探針在溶液中形成長(zhǎng)的鏈狀結(jié)構(gòu)傾向,，限制了它的組織穿透能力。適用于基因組DNA雜交,。由于原位雜交的探針將與高密度的細(xì)胞融合,，因此，需要減短探針的長(zhǎng)度或增加探針的濃度,，但是過(guò)高濃度的探針往往會(huì)增加非特異性結(jié)合,，因此每種探針應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)臐舛取?nbsp;
探針的獲得常采用隨機(jī)引物延伸法的PCR合成和擴(kuò)增，可獲大量的DNA探針,，或利用帶有噬菌體強(qiáng)啟動(dòng)子多克隆位點(diǎn)的質(zhì)粒載體來(lái)合成RMA探針,，也可利用質(zhì)粒菌擴(kuò)增質(zhì)粒，經(jīng)酶切后純化的基因片斷,，均可以獲得制備探針原料,。這些探針可以用同位素標(biāo)記，也可以用非同位素標(biāo)記,，即光敏生物標(biāo)記或地高辛配基標(biāo)記于脫氧脲嘧啶三磷酸核苷(dUTP)上形成的地高辛-dUTP,，可通過(guò)隨機(jī)引物或缺口平移法與探針的核酸分子相連，構(gòu)成地高辛一配基標(biāo)記的核酸探針,。比探針可用抗地高辛抗體偶聯(lián)酶或熒光素通過(guò)松體結(jié)合和底物顯色或產(chǎn)生熒光來(lái)檢測(cè),。
這些探針基本均有市售，無(wú)需自行制備,，只要根據(jù)說(shuō)明書使用即可,。
二、載玻片和蓋玻片預(yù)處理
為了防止探針的非特異貼附而保證細(xì)胞粘附而需處理：
1,、用于檢測(cè)rna的載玻片的處理
(1)用0.1mol/L HCL洗載玻片20分鐘,，再用無(wú)水乙醇洗數(shù)次使其干燥。
(2)在下列溶液中,，65℃處理2小時(shí)
3×SSC 0.02%FicoLL400 0.02%聚乙稀吡咯烷酮(PVP),。
(3)固定在乙醇/乙酸(3:1 V/V)20分鐘，180℃烘烤2小時(shí),。
2,、用于檢測(cè)DNA的載玻片的處理
以TESPA(three-amino-propyl-triethoxy-silane)涂載玻片。
3,、對(duì)于蓋玻片：于0.1mol/L HCL中浸泡20分鐘,，用無(wú)水乙醇洗，干燥后用二甲基氯化硅硅化,，180℃烤2小時(shí),。
三、組織細(xì)胞固定
理想的細(xì)胞固定過(guò)程應(yīng)該保護(hù)細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)確保目的基因DNA或RNA序列暴露,。對(duì)于RNA-RNA原位雜交有效的固定劑是4%多聚甲醛和PLPD（磷酸緩沖液PBS,、賴氨酸、過(guò)碘酸鹽及重酪酸鹽）,。
1,、涂片細(xì)胞原位雜交固定
(1)用含有0.02%EDTA的PBS洗滌細(xì)胞，于0.1%胰蛋白酶消化,，收獲細(xì)胞計(jì)數(shù),，涂載玻片上。
(2)若檢測(cè)RNA,，固定于4%多聚甲醛pH7.0,，在4℃下放60分鐘，PBS洗5分鐘,，系列乙醇脫水干燥,，-20℃保存。
(3)若檢測(cè)DNA,，固定在4%多聚甲醛16～24小時(shí),，0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分鐘，浸泡在下述溶液中2×5分鐘：
0.25%(v/v)Tritonx-100,；0.25%(v/v)Nonidet P40,；0.1mol/L Tris-HCL pH7.4；再用0.1mol/L Tris-HCL pH7.4洗2×5分鐘,。
(4)在100μg/ml蛋白酶K,，50mmol/L Tris-HCL PH8.0，5mmol/L EDTA溶液中,，37℃處理10分鐘,，再用含有甘氨酸的0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分鐘。
(5)在20%(v/v)乙酸中40℃處理15分鐘,，0.1mol/L Tris-HCL PH7.4洗2×5分鐘,。
注意：對(duì)于DNA-DNA原位雜交多聚甲醛或福爾馬林均可，但對(duì)于地高辛檢測(cè)法必須用4%多聚甲醛,，固定至少16小時(shí),，而且用蛋白酶K處理，這樣可明顯減少背景染色,。