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士鋒生物葡聚糖凝膠層析實驗介紹
點擊次數(shù)：958 發(fā)布時間：2014-4-21
凝膠層析又稱分子排阻層析或凝膠過濾,，是以被分離物質(zhì)的分子量差異為基礎的一種層析分離技術，這一技術為純化蛋白質(zhì)等生物大分子提供了一種非常溫和的分離方法,。層析的固定相載體是凝膠顆粒,，目前應用較廣的是：具有各種孔徑范圍的葡聚糖凝膠（Sephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）。
葡聚糖凝膠是由直鏈的葡聚糖分子和交聯(lián)劑3—氯1,，2—環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成的具有多孔網(wǎng)狀結構的高分子化合物,。凝膠顆粒中網(wǎng)孔的大小可通過調(diào)節(jié)葡聚糖和交聯(lián)劑的比例來控制，交聯(lián)度越大,，網(wǎng)孔結構越緊密,；交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔結構就越疏松,，網(wǎng)孔的大小決定了被分離物質(zhì)能夠自由出入凝膠內(nèi)部的分子量范圍,。可分離的分子量范圍從幾百到幾十萬不等,。
葡聚糖凝膠層析,，是使待分離物質(zhì)通過葡聚糖凝膠層析柱，各個組分由于分子量不相同,，在凝膠柱上受到的阻滯作用不同,，而在層析柱中以不同的速度移動。分子量大于允許進入凝膠網(wǎng)孔范圍的物質(zhì)*被凝膠排阻,，不能進入凝膠顆粒內(nèi)部,，阻滯作用小，隨著溶劑在凝膠顆粒之間流動,，因此流程短,，而先流出層析柱；分子量小的物質(zhì)可*進入凝膠顆粒的網(wǎng)孔內(nèi),，阻滯作用大,，流程延長，而zui后從層析柱中流出,。若被分離物的分子量介于*排阻和*進入網(wǎng)孔物質(zhì)的分子量之間,，則在兩者之間從柱中流出，由此就可以達到分離目的,。
本實驗以葡聚糖凝膠G—25作為固定相載體,，來分離藍色葡聚糖—2000和溴酚藍,。藍色葡聚糖—2000分子量接近2×106， 而溴酚藍分子量為670,，二者分子量相差較大,，前者*排阻，而后者則可*進入凝膠顆粒網(wǎng)孔內(nèi),，二者通過層析柱的時間不同而分開,。
生.物.秀實驗頻道 http://www.bbioo.com/Index.htm
【實驗材料】
1.實驗器材
層析柱(1×20cm)附有一小段乳膠管及螺旋夾；洗脫液瓶(帶下口的三角瓶,，250m1),；試管及試管架；量筒10m1,；721型分光光度計
2.實驗試劑
(1) Tris—醋酸緩沖液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900ml,，用濃醋酸調(diào)pH至7.0，加蒸餾水至1000m1,。
(2) 溴酚藍溶液：稱取溴酚藍10毫克,，溶于5毫升乙醇中，充分攪拌使其溶解,，然后逐滴加入Tris—醋酸緩沖液(pH7.0)至溶液呈深藍色,。
(3) 藍色葡聚糖—2000溶液：稱取藍色葡聚糖—2000 10毫克，溶于2毫升Tris—醋酸緩沖液(pH7.0)中即成,。
(4) 樣品溶液：取溴酚藍溶液0.1毫升,，藍色葡聚糖—2000溶液0.5毫升混勻后為上柱樣品溶液。
(5)葡聚糖凝膠G-25 (Sephadex-G-25)
【實驗操作】
1.實驗凝膠的制備：商品凝膠是干燥的顆粒,，使用時需經(jīng)溶脹處理,，稱取4克葡聚糖凝膠G—25，加50毫升蒸餾水,，攪拌均勻,，在室溫溶脹6小時，或沸水浴溶脹 2小時,，一般采用后一種方法,。再用傾瀉法除去凝膠上層水及細小顆粒，用蒸餾水反復洗滌幾次,，再以緩沖溶液(pH7.0的Tris—醋酸溶液)洗滌2—3次,，使pH和離子強度達到平衡，zui后抽去溶液及凝膠顆粒內(nèi)部氣泡,，凝膠可保存在緩沖液內(nèi),。
2.裝柱：將層析柱洗凈，垂直固定在鐵支架上,，選擇有薄膜端作為層析柱下口,，將下口接上乳膠管并用螺旋夾夾緊,。層析柱中加入洗脫液,，打開下口螺旋夾,，讓溶液流出，排除殘留氣泡,，zui后保留約2厘米高度的洗脫液,，擰緊螺旋夾。將凝膠輕輕攪動均勻,，用玻璃棒沿層析柱內(nèi)壁緩緩注入柱中,，待凝膠沉積到柱床下已超過l厘米時，打開下口螺旋夾,，繼續(xù)裝柱至柱床高度達到8厘米,關閉出口,。裝柱過程中嚴禁產(chǎn)生氣泡，盡可能一次裝完,，避免出現(xiàn)分層,。再用洗脫液平衡l至2個柱床體積，凝膠面上始終保持有一定的洗脫液,。平衡后,，擰緊下端螺旋夾。
3.加樣品：打開螺旋夾使柱面上的洗脫液流出,，直至床面與液面剛好平齊為止,，關閉下端出口。取溴酚藍及藍色葡聚糖—2000混合液0.3毫升,，小心地加于凝膠表面上,，切勿攪動層析柱床表面。打開下端出口,，使樣品溶液進入凝膠內(nèi),，并開始收集流出液。當樣品溶液恰好流至與凝膠表面平齊時,，關閉下端出口,。用少量洗脫液清洗層析柱加樣區(qū)，共洗滌三次,，每次清洗液應*進入凝膠柱內(nèi)后,，再進行下一次洗滌。zui后在凝膠表面上加入洗脫液,，保持高度為3—4cm,。
4.洗脫與收集：連接好凝膠柱層析系統(tǒng)，調(diào)節(jié)洗脫液流速為每分鐘1毫升,，進行洗脫,。仔細觀察樣品在層析柱內(nèi)的分離現(xiàn)象,，收集洗脫液，每收集3毫升即換一支收集管(試管預先編號),，收集約20管左右,，樣品即可*被洗脫下來。將各收集管中的洗脫液分別用721型分光光度計在波長540nm處測定其光密度,。
5.凝膠回收處理方法：將樣品*洗脫下來后,，繼續(xù)用三倍柱床體積的洗脫液沖洗凝膠后，將柱下口放在小燒杯中,，慢慢打開,，再將上口慢慢松開，使凝膠全部回收至小燒杯中,，備用,。
【實驗結果】
以洗脫管號為橫坐標，以光密度為縱坐標作圖即得洗脫曲線,。分析曲線圖并討論實驗結果,。