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士鋒生物植物過(guò)氧化物酶同工酶測(cè)定
點(diǎn)擊次數(shù)：856 發(fā)布時(shí)間：2014-4-14
凡能催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其分子結(jié)構(gòu)和帶電性質(zhì)不同的一組酶稱(chēng)同工酶（isoenzyme）,。同工酶譜的差異是基因表達(dá)的差異造成的,，所以在研究植物基因調(diào)控與生長(zhǎng)發(fā)育及其與環(huán)境條件的關(guān)系以及許多生理生化和遺傳問(wèn)題時(shí)，常常要分析同工酶譜的差異,。因此,，同工酶研究在理論和實(shí)踐中都有非常重要的意義。
一,、原理
聚丙烯酰胺凝膠由丙烯酰胺和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺在催化劑作用下聚合而成,，具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)孔大小可由凝膠濃度和交聯(lián)度加以調(diào)節(jié),。凝膠電泳兼有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng),。被分離物質(zhì)由于所載電荷數(shù)量、分子大小和形狀的差異,，因此在電泳時(shí)產(chǎn)生不同的泳動(dòng)速率而相互分離,。利用特異性的顏色反應(yīng)使待測(cè)酶著色，這樣就可在凝膠中展現(xiàn)出酶譜,。過(guò)氧化物酶是植物體內(nèi)常見(jiàn)的氧化酶,。植物體內(nèi)許多生理代謝過(guò)程常與它的活性及其同工酶的種類(lèi)有關(guān)。利用過(guò)氧化物酶能催化H2O2把聯(lián)苯胺氧化成藍(lán)色或棕褐色產(chǎn)物的原理,，將經(jīng)過(guò)電泳后的凝膠置于有H2O2及聯(lián)苯胺的溶液染色,，出現(xiàn)藍(lán)色或棕褐色部位即為過(guò)氧化物酶同工酶在凝膠中存在的位置，多條有色帶即構(gòu)成過(guò)氧化物酶同工酶譜,。本實(shí)驗(yàn)利用連續(xù)的盤(pán)狀凝膠電泳,，采用Tris－Gly緩沖系統(tǒng)來(lái)分離陰離子過(guò)氧化物酶同工酶。
二,、材料,、儀器設(shè)備及試劑
（一）材料：小麥芽
（二）儀器設(shè)備： 1. 穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀；2. 冷凍離心機(jī)及離心管,；3. 成套電泳槽（圓盤(pán)型）,；4. pH試紙；5. 其它常規(guī)用具,。
（三）試劑： 1. 分離膠緩沖液（pH8.9）：1mol/L HCl 48ml,，Tris36.6g，TEMED0.23ml,，加水定容至100ml,。2. 分離膠貯液：30g丙烯酰胺,，0.8g甲叉雙丙烯酰胺，加水溶解并定容至100ml,，過(guò)濾后使用,。3. 過(guò)硫酸銨溶液：過(guò)硫酸銨0.2g，加水定容至100ml制膠時(shí)現(xiàn)配現(xiàn)用）,。4. 濃縮膠緩沖液：1mol/L HCl48ml＋Tris5.98g＋TEMED0.46ml,，調(diào)pH6.7，并定容至100ml,。5. 濃縮膠貯備液：丙烯酰胺10g,，甲叉雙丙烯酰胺2.5g加水定容到100ml，使用前過(guò)濾,。6. 電極緩沖液：Tris 6.0g,，Gly 28.8g， 用水定容至1000ml（pH8.3）,，用前稀釋10倍。 7. 四甲基乙二胺（TEMED）,。8. 0.1％的溴酚藍(lán)水溶液,。9. 聯(lián)苯胺染色母液：聯(lián)苯胺1g＋冰醋酸18ml＋H2O2ml溶解貯于棕色瓶中。
三,、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 安裝電泳槽
2. 凝膠的配制
3. 過(guò)氧化物酶的提取 稱(chēng)取1g待測(cè)植物鮮樣置于冰浴上的研缽內(nèi),，加入1mlH2O或0.05mol/L Tris－HCl緩沖液（pH6，8）研成勻漿,，轉(zhuǎn)入離心管,，再用2ml前述溶液將附著在研缽壁上的研磨樣品洗下并全部轉(zhuǎn)入離心管，3500rpm離心15～20min,，其上清液即為酶的提取液,，供電泳分析用。
4. 點(diǎn)樣：用微量注射器吸取上清液,，每管加樣50μl,，再分別加入40％蔗糖溶液5μl，之后再用注射器將電極緩沖液慢慢加入每支膠管至浸沒(méi)頂部為止.zui后向上,、下電泳槽倒入電極緩沖液（上槽必須淹沒(méi)管頂,，下槽液要能浸泡著凝膠管），zui后在上槽液中滴入1～2滴溴酚藍(lán)溶液,。
5. 電泳：將電泳槽放至低溫處,，在4℃左右，或接通電泳槽水冷卻系統(tǒng)按上“一”下“＋”接好導(dǎo)線(xiàn),，通電,，電泳開(kāi)始電流應(yīng)低,，每管1mA，10min后,，再加大電流,，使每管達(dá)到2～3mA，當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑達(dá)到距管底約1cm處時(shí),，切斷電流,，停止電泳。
6. 剝膠：電泳完畢,，將電泳槽取出,，倒去緩沖液，取下凝膠管,，放入培養(yǎng)皿中,。用一個(gè)帶有長(zhǎng)針頭的注射器，吸滿(mǎn)水,，將針頭沿管壁插入,，同時(shí)慢慢地將注射器中的水推出，并不斷轉(zhuǎn)動(dòng)凝膠管,，將凝膠管擠脫出來(lái),，也可用洗耳球擠壓。
7. 染色：取0.5ml聯(lián)苯胺母液＋H2O 9.3ml＋0.2ml3％H2O2,，混勻后倒入盛有凝膠條的培養(yǎng)皿,。此時(shí)可以看到膠條上出現(xiàn)藍(lán)色或棕褐色環(huán)，即過(guò)氧化物酶帶,，約十min后用自來(lái)水沖洗,，這時(shí)藍(lán)色帶也慢慢變成棕褐色。
8. 記錄酶譜,，并計(jì)算各同工酶的遷移率,。