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士鋒生物植物組織中氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)及氨基酸的層析分離
點(diǎn)擊次數(shù)：926 發(fā)布時(shí)間：2014-4-8
一、目的
轉(zhuǎn)氨基作用是植物界普遍存在的一種生化反應(yīng),，它使蛋白質(zhì),、氨基酸代謝
與碳水化合物、脂肪等代謝溝通起來(lái),，在一定程度上起平衡蛋白質(zhì),、脂肪等代
謝的作用。研究植物體轉(zhuǎn)氨基作用,，可以使我們了解植物體不同發(fā)育階段代謝
動(dòng)態(tài)的一個(gè)側(cè)面,，從而探索控制其代謝的途徑。
二,、原理
通過(guò)轉(zhuǎn)氨基作用,，α—氨基酸上的氨基可能轉(zhuǎn)移到α—酮基的位置上，結(jié)
果形成一種新的α—酮酸和一種新的α—氨基酸,。所生成的氨基酸可用紙上層
析法檢出,。
三、儀器和試劑
1．儀器：
研 缽 恒溫箱 量筒（10毫升）
離心機(jī) 試管3支 層析缸
濾 紙 吹風(fēng)機(jī) 移液管（0.5ml×3,；2ml×1）
毛細(xì)管 漏 斗 離心管
2．試劑：
（1）0.1M丙氨酸
（2）0.1Mα—酮戊二酸（NaOH中和至pH7）
（3）含有0.4M蔗糖的0.1M pH8.0磷酸緩沖液
（4）0.1M谷氨酸,、0.1—0.25%茚三酮丙酮溶液
（5）推動(dòng)劑（酚：水＝3：1或4：1）
四、操作
1.酶液的制備：取發(fā)芽2-3 日的綠豆芽3 克（去皮）,，放入研缽中,，加2
毫升pH8.0磷酸緩沖液研成勻漿,，轉(zhuǎn)入離心管。研缽再用2毫升緩沖液沖洗,，
并入離心管,，于8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清液備用,。
2．酶促反應(yīng)：取三支試管,，按下表分別加入試劑和酶液：
植物組織中氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)及氨基酸的層析分離
搖勻后置試管于37℃恒溫中保溫30分鐘。取出后各加3滴30%乙酸終止酶活動(dòng),，于沸水浴上加熱10分鐘,，使蛋白質(zhì)*沉淀，冷卻后離心或過(guò)濾,、取上清液或?yàn)V液備用,。
3．層析：取層析濾紙一張，在距底邊2厘米處用鉛筆劃一水平線,，在線上等距確定5個(gè)點(diǎn),，作點(diǎn)樣位置。相鄰各點(diǎn)相距2.5厘米,。取上述上清液或?yàn)V液及谷氨酸,、丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)液用五支毛細(xì)玻管分別點(diǎn)樣。反應(yīng)液點(diǎn)5-6滴,，標(biāo)準(zhǔn)液點(diǎn)2滴,。每點(diǎn)一次用吹風(fēng)機(jī)吹干后再點(diǎn)下一次。不要點(diǎn)得太多,，斑點(diǎn)直徑不超過(guò)3 ㎜為宜（5 支毛細(xì)管勿混淆）,。
在層析缸中放入酚水推動(dòng)劑(3：1或4：1)，待缸內(nèi)蒸氣飽和后,，將濾紙垂直放入,，展層，層析紙紙邊不能迭在一起或與缸壁接觸,。蓋好缸蓋,，待溶劑上升至10-15 ㎝時(shí)，小心取出濾紙用鉛筆劃出溶劑前沿線,，用電吹風(fēng)烘干,。
4．顯色：用噴霧器噴上0.1%茚三酮丙酮溶液，置烘箱(80℃)或用熱吹風(fēng)機(jī)加熱顯色,，此時(shí)可見(jiàn)紫色斑點(diǎn),。
五、結(jié)果分析
樣品層析后，常用相對(duì)移動(dòng)速率Rf 來(lái)表示各組分在層析譜上的位置：
植物組織中氨基轉(zhuǎn)移反應(yīng)及氨基酸的層析分離
Rf 值與欲分離物質(zhì)的性質(zhì)存在一定的關(guān)系,，在一定條件下是常數(shù),。從層析圖譜上鑒定α-酮戊二酸和丙氨酸是否發(fā)生了轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)并寫(xiě)出反應(yīng)式。
六,、注意事項(xiàng)
1.品不要點(diǎn)得太多,，斑點(diǎn)直徑不超過(guò)3 ㎜為宜。
2. 層析紙質(zhì)量要好一點(diǎn),，否則容易彎曲,，層析效果不好。層析時(shí),，且紙邊不能迭在一起或與缸壁接觸,。