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士鋒生物微生物的誘變育種
點(diǎn)擊次數(shù)：1039 發(fā)布時間：2014-4-3
一,、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蛢?nèi)容
目的：以紫外線誘變獲得用于醬油生產(chǎn)的高產(chǎn)蛋白酶菌株為例,，學(xué)習(xí)微生物誘變育種的基本操作方法,。
內(nèi)容：1．對米曲霉(Aspergills oryzae )出發(fā)菌株進(jìn)行處理，制備孢子懸液,。
2．用紫外線進(jìn)行誘變處理,。
3．用平板透明圈法進(jìn)行兩次初篩。
4．用搖瓶法進(jìn)行復(fù)篩及酶活性測定,。
二,、實(shí)驗(yàn)材料和用具
米曲霉斜面菌種；
豆餅斜面培養(yǎng)基,、酪素培養(yǎng)基,、蒸餾水、0.5%酪蛋白,；
三角瓶(300mL,、500mL)、試管,、培養(yǎng)皿(9cm),、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱,、紫外照射箱,、磁力攪拌器、脫脂棉,、無菌漏斗,、玻璃珠、移液管,、涂布器,、酒精燈。
三,、操作步驟
(一)出發(fā)菌株的選擇及菌懸液制備
1．出發(fā)菌株的選擇 可直接選用生產(chǎn)醬油的米曲霉菌株,，或選用高產(chǎn)蛋白酶的米曲霉菌株。
2. 菌懸液制備 取出發(fā)菌株轉(zhuǎn)接至豆餅斜面培養(yǎng)基中,，30℃培養(yǎng)3～5d 活化,。然后孢子洗至裝有1mL 0.lmol/L pH6.0 的無菌磷酸緩沖液的三角瓶中(內(nèi)裝玻璃珠，裝量以大致鋪滿瓶底為宜),，30℃振蕩30min,，用墊有脫脂棉的滅菌漏斗過濾，制成把子懸液,，調(diào)其濃度為106～108 個/mL,，冷凍保藏備用。
(二)誘變處理
用物理方法或化學(xué)方法，所用誘變劑種類及劑量的選擇可視具體情況決定,，有時還可采用復(fù)合處理,，可獲得更好的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)學(xué)習(xí)用紫外線照射的誘變方法,。
1．紫外線處理 打開紫外燈(30W)預(yù)熱20min,。取5mL 菌懸液放在無菌的培養(yǎng)皿(9cm)中,，同時制作5 份,。逐一操作，將培養(yǎng)皿平放在離紫外燈30cm(垂直距離)處的磁力攪拌器上,，照射l min 后打開培養(yǎng)皿蓋,，開始照射，與照射處理開始的同時打開磁力攪拌器進(jìn)行攪拌,，即時計算時間,，照射時間分別為15 s、30 s,、l min,、2 min、5 min,。照射后,，誘變菌液在黑暗冷凍中保存1～2h 然后在紅燈下稀釋涂菌進(jìn)行初篩。
2．稀釋菌懸液 按10 倍稀釋至10-6,，從10-5 和10-6 中各取出0.lmL 加入到酪素培養(yǎng)基平板中(每個稀釋度均做3 個重復(fù)),，然后涂菌并靜置，待菌液滲入培養(yǎng)基后倒置,，于30℃恒溫培養(yǎng)2～3d,。
(三)優(yōu)良菌株的篩選
1. 初篩 首先觀察在菌落周圍出現(xiàn)的透明圈大小，并測量其菌落直徑與透明圈直徑之比,，選擇其比值大且菌落直徑也大的菌落40～50 個,，作為復(fù)篩菌株。
2．平板復(fù)篩 分別倒酪素培養(yǎng)基平板,，在每個平皿的背面用紅筆劃線分區(qū),，從圓心劃線至周邊分成8 等份，1～7 份中點(diǎn)種初篩菌株,，第8 份點(diǎn)種原始菌株,，作為對照。培養(yǎng)48h 后即可見生長,，若出現(xiàn)明顯的透明圈,，即可按初篩方法檢測，獲得數(shù)株二次優(yōu)良菌株，進(jìn)大搖瓶復(fù)篩階段,。
3．搖瓶復(fù)篩 將初篩出的菌株,，接入米曲霉復(fù)篩培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，其方法是,，稱取麥秩85g,，豆餅粉(或面粉)15g，加水95～110mL(稱為潤水),，水含量以手捏后指縫有水而不
下滴為宜,，于500mL 三角瓶中裝入15～20g(料厚為1～1.5cm)，121℃濕熱滅菌30min,，然后分別接入以上初篩獲得的優(yōu)良菌株,，30℃培養(yǎng)，24h 后搖瓶一次并均勻鋪開,，再培養(yǎng)24～48h,，共培養(yǎng)3～5d 后檢測蛋白酶活性。
4．蛋白酶的測定方法
(1)取樣：培養(yǎng)后隨機(jī)稱取以上搖瓶培養(yǎng)物1g,，加蒸餾水100mL,，(或200mL),40℃水浴，浸酶1h,，取上清浸液測定酶活性,。另取lg 培養(yǎng)物于105℃烘干測定含水量。
(2)酶活性測定：30℃ pH7.5 條件下水解酪蛋白(底物為0.5%酪蛋白),，每分鐘產(chǎn)酪氨酸1μg 為一個酶活力單位,。計算公式為：
(A 樣品OD680nm 值-A 對照OD680nm 值)×K×V/t×N
K：標(biāo)準(zhǔn)曲線中光吸收為“1”時的酪氨酸微克數(shù)；
V：酶促反應(yīng)的總體積,；
t： 酶促反應(yīng)時間(min),；
N：酶的稀釋倍數(shù)。
5．谷氨酸的檢測 此項檢測也是醬油優(yōu)良菌株的重要指標(biāo)之一,。
檢測培養(yǎng)基：豆餅粉：麩夫=6：4,，潤水75%，121℃濕熱滅菌30min,。
谷氨酸測定：于以上培養(yǎng)基中加入7%鹽水(W/V),，40～45℃水浴，水解9d 后過濾,，以濾液檢測谷氨酸含量(測壓法),。
四、注意事項
1. 紫外線照射時注意保護(hù)眼睛和皮膚,。
2. 誘變過程及誘變后的稀釋操作均在紅燈下進(jìn)行,，并在黑暗中培養(yǎng),。
五、實(shí)驗(yàn)報告
1. 試列表說明高產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選過程和結(jié)果,。
2. 你認(rèn)為以上的篩選方法有什么優(yōu)缺點(diǎn),，如何改進(jìn)？
六,、問題和思考
1．試述紫外線誘變的作用機(jī)理及其在具體操作中應(yīng)注意的問題,。
2．為什么在誘變前要把菌懸液打散和培養(yǎng)一段時間？
注：篩選菌株數(shù)的計算 若按突變率為0.01 計算,，則一次篩選可取250—300 個菌落,，
*次篩選后可多選幾株高產(chǎn)株，而二級篩選為重點(diǎn)階段,，其zui適量可參考以下計算方法：如初篩菌株數(shù)為200 株,，二次篩選欲選株數(shù)為2 株，則二級應(yīng)選(200×2)1/2,，為20 株，這樣的數(shù)量選擇,，使有可能從較少的數(shù)量中獲得相對較多的優(yōu)良菌株,。