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士鋒生物大腸菌群介紹與檢測方法
點(diǎn)擊次數(shù)：1215 發(fā)布時(shí)間：2014-4-2
一,、大腸菌群介紹
大腸菌群并非細(xì)菌學(xué)分類命名,，而是衛(wèi)生細(xì)菌領(lǐng)域的用語,，它不代表某一個(gè)或某一屬細(xì)菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌,，這些細(xì)菌在生化及血清學(xué)方面并非*一致,，其定義為：需氧及兼性厭氧,、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。一般認(rèn)為該菌群細(xì)菌可包括大腸埃希氏菌,、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等,。
大腸菌群分布較廣,，在溫血動物糞便和自然界廣泛存在,。調(diào)查研究表明,，大腸菌群細(xì)菌多存在于溫血動物糞便,、人類經(jīng)?；顒拥膱鏊约坝屑S便污染的地方，人,、畜糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。糞便中多以典型大腸桿菌為主,，而外界環(huán)境中則以大腸菌群其他型別較多,。
大腸菌群是作為糞便污染指標(biāo)菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染,。大腸菌群數(shù)的高低,，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小,。糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人糞便,，也有腸道患者或帶菌者的糞便,，所以糞便內(nèi)除一般正常細(xì)菌外，同時(shí)也會有一些腸道致病菌存在（如沙門氏菌,、志賀氏菌等），因而食品中有糞便污染,，則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性,，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險(xiǎn)性,。
大腸菌群是評價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)之一,，目前已被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生工作中。
二,、檢驗(yàn)方法：
由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即：需氧及兼性厭氧,、在37℃能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進(jìn)行,。
目前國內(nèi)采用的進(jìn)出口食品大腸菌群檢測方法主要有國家標(biāo)準(zhǔn)和原國家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),。兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法在檢測程序上略有不同。
（一）國家標(biāo)準(zhǔn)：國家標(biāo)準(zhǔn)采用三步法,，即：乳糖發(fā)酵試驗(yàn),、分離培養(yǎng)和證實(shí)試驗(yàn)。
乳糖發(fā)酵試驗(yàn)：樣品稀釋后,，選擇三個(gè)稀釋度,，每個(gè)稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。36±1℃培養(yǎng)48±2h,，觀察是否產(chǎn)氣,。
分離培養(yǎng)：將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上,，36±1℃培養(yǎng)18-24h,，觀察菌落形態(tài),。
證實(shí)試驗(yàn)：挑取平板上的可疑菌落,，進(jìn)行革蘭氏染色觀察。同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管36±1℃培養(yǎng)24±2h,，觀察產(chǎn)氣情況。
報(bào)告：根據(jù)證實(shí)為大腸桿菌陽性的管數(shù),，查MPN表，報(bào)告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。
具體操作參見GB4789.3-94 《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn) 食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群測定》
（二）原國家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),，等效采用美國FDA的標(biāo)準(zhǔn)方法,，用于對出口食品中的大腸桿菌進(jìn)行檢測。本方法采用兩步法：
推測試驗(yàn)：樣品稀釋后,，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯,。36±1℃培養(yǎng)48±2h,，觀察是否產(chǎn)氣,。
證實(shí)試驗(yàn)：將產(chǎn)氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中,，36±1℃培養(yǎng)48±2h,，觀察是否產(chǎn)氣。以BGLB產(chǎn)氣為陽性,。查MPN表,，報(bào)告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值,。
具體操作參見 SN0169-92 《中華人民共和國進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗(yàn)方法》
三,、說明：
1．MPN檢索表：
MPN 為zui大可能數(shù)(Most Probable Number)的簡稱,。這種方法，對樣品進(jìn)行連續(xù)系列進(jìn)行稀釋,，加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)zui近似的數(shù)值,。
MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度,，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍,。注意國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中所附MPN表所用稀釋度是不同的，而且結(jié)果報(bào)告單位也不相同,。
2．初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn)：
無論是國家標(biāo)準(zhǔn)的三步法還是行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的兩步法,，都利用了乳糖發(fā)酵管進(jìn)行了兩次發(fā)酵試驗(yàn)，培養(yǎng)基的配制略有不同,，但都是為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義,，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。
初發(fā)酵陽性管,，不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌,，經(jīng)過證實(shí)試驗(yàn)后,，有時(shí)可能成為陰性,。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率,，初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差較大。因此,，在實(shí)際檢測工作中,，證實(shí)試驗(yàn)是必需的,。
3．產(chǎn)氣量與倒管：
在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)工作中,，經(jīng)?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時(shí)比小米粒還?。袝r(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡,。實(shí)驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量,，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體,，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡,。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時(shí)，可以用手輕輕打動試管,，如有氣泡沿管壁上浮,，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生,，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn),。
4．挑選菌落：
國家標(biāo)準(zhǔn)中，需要對初發(fā)酵陽性培養(yǎng)物接種伊紅美藍(lán)平板分離,，對典型和可疑菌落進(jìn)行觀察和證實(shí)試驗(yàn),。由于大腸菌群是一群細(xì)菌的總稱,，在平板大腸菌群菌落的色澤,、形態(tài)等方面較大腸菌更為復(fù)雜和多樣，而且與大腸菌群的檢出率密切相關(guān),。國家標(biāo)準(zhǔn)方法規(guī)定伊紅美藍(lán)平板為分離培養(yǎng)基，在該平板上,，大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無光澤時(shí),，檢出率zui高,；紅色、粉紅色菌落檢出率較低,。
另外，挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關(guān)系,，只挑取一個(gè)菌落,，由于機(jī)率問題，尤其當(dāng)菌落不典型時(shí),，很難避免假陰性的出現(xiàn),。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無典型菌落則應(yīng)多挑幾個(gè),，以免出現(xiàn)假陰性,。
5．抑菌劑：
大腸菌群檢驗(yàn)中常用的抑菌劑有膽鹽,、十二烷基硫酸鈉,、洗衣粉,、煌綠,、龍膽紫,、孔雀綠等,。抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌,，特別是革蘭氏陽性菌的生長。
國家標(biāo)準(zhǔn)中乳糖膽鹽發(fā)酵管利用膽鹽作為抑菌劑,，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中LST肉湯利用十二烷基硫酸鈉作為抑菌劑,，BGLB肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑,。
抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌,，而有利于大腸菌群細(xì)菌的生長和挑選，但對大腸菌群中的某些菌株有時(shí)也產(chǎn)生一些抑制作用,。有些抑菌劑用量甚微，稱量時(shí)稍有誤差,，即可對抑菌作用產(chǎn)生影響,，因此抑菌劑的添加應(yīng)嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。