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士鋒生物植物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)技術(shù)
點擊次數(shù)：1160 發(fā)布時間：2014-3-21
將游離的植物細(xì)胞或小的細(xì)胞團(tuán)置于液體培養(yǎng)其中進(jìn)行培養(yǎng)和生長的一種技術(shù)，稱為植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng),。它是從愈傷組織的液體培養(yǎng)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的培養(yǎng)技術(shù),。從50年代起，米爾（Muir）等便對單細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行了探討和研究,，得到了萬壽菊,，煙草單細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)的懸浮液。1958年斯圖爾德（F.C.Steward）等進(jìn)行了胡蘿卜愈傷組織的懸浮培養(yǎng),，并得到了完整的再生植株,。
三十多年來，從試管的懸浮培養(yǎng)發(fā)展到大空量的發(fā)酵罐培養(yǎng),，從不連續(xù)培養(yǎng)發(fā)展到半連續(xù)和連續(xù)培養(yǎng),。80年代以來，作為生物技術(shù)中的一個組成部分,，正在發(fā)展成為一門新興的產(chǎn)業(yè)體系。懸浮培養(yǎng)技術(shù)為研究植物細(xì)胞的生理,、生化,、遺傳和分化的機理提供實驗材料，也為利用植物細(xì)胞進(jìn)行次和代謝物的工業(yè)生產(chǎn)提供技術(shù)基礎(chǔ)。此外,，還在育種,、快速繁殖、原生質(zhì)體培養(yǎng),，體細(xì)胞雜交以及作為基因轉(zhuǎn)化的受體等方面均得到了廣泛地應(yīng)用,。
由于植物細(xì)胞具有聚集在一起的特性，因此,，在分裂后,，往往不能像細(xì)菌細(xì)胞那樣各自分開，而是大多以細(xì)胞團(tuán)的形式存在,，至今還不能培養(yǎng)*是單細(xì)胞的縣浮液,。要進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)或選擇細(xì)胞無性紗，需要進(jìn)行平板培養(yǎng),，微室培養(yǎng)和看護(hù)培養(yǎng),。本實驗僅介紹zui常用的縣浮培養(yǎng)技術(shù)。
一,、實驗?zāi)康模?br />1． 掌握植物懸浮細(xì)胞系建立的方法,，原理。
2． 學(xué)會對懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)及繪制細(xì)胞生長曲線,。
二,、實驗原理：
植物離體培養(yǎng)可產(chǎn)生愈傷組織。將疏松型的愈傷組織縣浮在液體培養(yǎng)基中并在振蕩條件下培養(yǎng)一段時間后,，可形成分散縣浮培養(yǎng)物,。良好的縣浮培養(yǎng)物應(yīng)具備以下特征：（1）主要有單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)組成；（2）細(xì)胞具有量盛的生長和分裂能力,，增殖速度快,；（3）大多數(shù)細(xì)胞在形態(tài)上應(yīng)具有分生細(xì)胞的特征，它們多呈等徑形,，核一質(zhì)比率大,，胞質(zhì)濃厚，無液胞化程度較低,。要建成這樣的縣浮培養(yǎng)體系,，首先需要有良好的起始培養(yǎng)物——迅速增殖的疏松型愈組織。然后經(jīng)過培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件的選擇,，并經(jīng)多次斷代培養(yǎng)才能達(dá)到,。縣浮培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)長期繼代培養(yǎng)后,，染色體常有變異現(xiàn)象,，細(xì)胞的再生能力也有逐漸降低的趨勢,，然而對于以上生產(chǎn)有用代謝特質(zhì)為目的的大量培養(yǎng)，這種再生能力的降低不一定有不良影響,。
2．材料
松軟的煙草或胡蘿卜愈傷組織,。
3．試劑
（1）附加2%蔗糖，1%甘露醇,，500mg/L水解乳蛋白,，1。5ml/L,，2,，4-D的MS培養(yǎng)基，PH調(diào)到5.6~6.2,。
（2）8%三氧化鉻（CrO3）,。
三、實驗方法
1.用鑷子夾取出生長旺盛的松軟愈傷組織,，放入三角瓶中并輕輕夾碎,。每100ml三角瓶含滅過菌MS培養(yǎng)基10~15ml，每瓶接種1~1.5g愈傷組織,，以保證zui初培養(yǎng)物中有足夠量的細(xì)胞,。
2.將已接種的三角置于旋轉(zhuǎn)式搖床上。在100r/min,，25~28℃條件下,，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。
3.經(jīng)6~10天培養(yǎng)后,，若細(xì)胞明顯增殖,，可向培養(yǎng)瓶中加新鮮培養(yǎng)基10ml，必要時,，可用大口移液管將培養(yǎng)物分裝成兩瓶,，繼續(xù)培養(yǎng)。（若細(xì)胞無明顯增殖,，可能是起始材料不適當(dāng),，應(yīng)考慮用旺盛增殖期的愈傷組織重新接種）?？蛇M(jìn)行*次繼代培養(yǎng),。
4.縣浮培養(yǎng)物的過濾：按“3”法繼代培養(yǎng)幾代后，培養(yǎng)液中應(yīng)主要由單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)（不多于20個細(xì)胞）組成,。若仍含有效大的細(xì)胞團(tuán),，可用適當(dāng)孔徑的金屬網(wǎng)篩過濾，再將過濾后的縣浮細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng),。
5.細(xì)胞計算,。取一定體積的細(xì)胞縣液,，加入2倍體積的8%的三氧化鉻（CrO3），置700C水浴處理15min,。冷卻后，用移液管重復(fù)吹打細(xì)胞懸液,，以使細(xì)胞充分分散,，混勻后，取一滴縣液置入血細(xì)胞計數(shù)板上計數(shù),。
6.制作細(xì)胞生長曲線：為了解縣浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長動態(tài),，可用以下方法繪制生長曲線圖：
（1）鮮重法（fresh weigh method）
在轉(zhuǎn)代培養(yǎng)的不同時間，取一定體積的懸浮細(xì)胞培養(yǎng)物,，離心收集后,，稱量細(xì)胞的鮮重，以鮮重為縱座標(biāo),，培養(yǎng)時間為橫座標(biāo),，繪制鮮重增長曲線。
（2）干重法（dry weigh method ）
可在稱量鮮重之后,，將細(xì)胞進(jìn)行曲烘干,，再稱量干重。以干重為縱坐標(biāo),，培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo),，繪制細(xì)胞干重生長曲線。
上述兩種方法均需每隔2天取樣一次,，共取7次,，每個樣品重復(fù)三次，整個實驗進(jìn)行期間不再往培養(yǎng)瓶中換入新鮮培養(yǎng)液,。
7.細(xì)胞活力的檢查,。對于初學(xué)者，往往需要檢測活細(xì)胞的比率,?？稍谂囵B(yǎng)的不同階段，吸取一滴細(xì)胞縣液,，放在載玻片上,，滴一滴0。1%的酚藏花紅溶液（用培養(yǎng)基配制）染色,，在顯微鏡下觀察,。幾活細(xì)胞均不著色，而死細(xì)胞則很快被染成紅色,。也可用0,。1%熒光雙醋酸酯溶液染色,，凡活細(xì)胞將在紫外光誘發(fā)下顯示藍(lán)絕色熒光，有經(jīng)驗的操作者,，則可根據(jù)細(xì)胞形態(tài),，胞質(zhì)環(huán)流判別細(xì)胞的死活。
8.細(xì)胞再生能力的鑒定：為了解懸浮培養(yǎng)細(xì)胞是否仍具有再生能力,，可將培養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到瓊脂固化的培養(yǎng)基上,，使基再形成愈傷組織，進(jìn)而在分化培養(yǎng)基上,，誘導(dǎo)植株的分化,。
四、注意事項：
1.上述步驟均滅菌操作,，培養(yǎng)基,、用具、器皿等要高壓滅菌后方可使用,。
2.如培養(yǎng)液混濁或呈現(xiàn)乳白色,，表明已污染。
3.每次繼代培養(yǎng)時,，應(yīng)在倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)物中各類細(xì)胞及其它殘余物的情況以有意識地留下圓細(xì)胞,，棄去長細(xì)胞。