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植物組織中脂肪氧化酶活力的測(cè)定
點(diǎn)擊次數(shù)：859 發(fā)布時(shí)間：2014-3-18
脂肪氧化酶（LOX）是一種含非血紅素鐵的蛋白質(zhì)，專一催化具有順,、順-1,4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸加氧反應(yīng),，氧化生成具有共軛雙鍵的過(guò)氧化氫物。它廣泛存在于高等植物體內(nèi),，與植物的生長(zhǎng)發(fā)育,、植物的衰老、脂質(zhì)過(guò)氧化作用和光合作用,、傷反應(yīng)及其他脅迫反應(yīng)等有關(guān),。
【原理】
根據(jù)基質(zhì)濃度一定、反應(yīng)體系中溶解氧濃度的變化與酶活力大小呈線性相關(guān)的原理進(jìn)行測(cè)定,。LOX氧化多元不飽和脂肪酸形成具有共軛雙鍵的過(guò)氧化氫物時(shí)消耗氧氣,，溶液中氧濃度的減少速率與酶活力大小成正比，利用氧電極可以地測(cè)定酶活力,。
【儀器與用具】
氧電極1套,；記錄儀1臺(tái)；超級(jí)恒溫水浴鍋1臺(tái),；離心機(jī)1臺(tái),；抽濾器1套；1ml注射器1支,；吸量管：5ml 1支,，1ml 1支,；吸耳球1個(gè)；小研缽1套,；剪刀1把,。
【試劑】
0.25%亞油酸；Tris-鹽酸緩沖液（25mmol/L,，pH7.5）,；石英砂；0.5mol/L氯化鉀溶液,；
【方法】
1.樣品提取 取新鮮植物樣品,，擦凈組織表面污物，剪碎混勻,，稱取0.5g放入研缽中,，加入5ml 25mmol/L Tris-鹽酸緩沖液（pH7.5），于冰浴中研磨,，研成均漿,，利用高速冷凍離心機(jī)于0~4℃條件下離心（4000×g）5min，上清液為粗酶提取液,。
2.測(cè)定 氧電極的操作方法見儀器的操作手冊(cè),。開啟恒溫水浴，調(diào)節(jié)測(cè)定溫度為25℃,。
洗凈氧電極反應(yīng)杯,，先加入2.5mlTris-鹽酸緩沖液、1ml酶提取液,，放松磁力攪拌制動(dòng)器,，保溫平衡5~10min，制動(dòng)磁塊,，把電極插入反應(yīng)杯中,，從狹槽中排出全部空氣，用1ml注射器加長(zhǎng)針頭從狹槽中注入0.25%亞油酸0.2ml,，打開記錄儀記錄耗氧曲線（走紙速度的大小視酶活力確定,，曲線呈45度角為宜），測(cè)定5min,，吸取廢液,，清洗反應(yīng)杯進(jìn)行下一個(gè)樣品的測(cè)定。
3.計(jì)算結(jié)果
本實(shí)驗(yàn)以空氣飽和水中的含氧量為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)電極進(jìn)行標(biāo)定,，求算出測(cè)定溫度下,，記錄紙每個(gè)小格所代表氧量的變化值。
從樣品測(cè)定曲線上選定耗氧的下降格數(shù)（n）,，根據(jù)走紙速度（v）和下降n格走紙的距離（L）,，可求出測(cè)定液中耗氧的變化速率（R）：
R（μmol O2/min）＝n×μmol O2/格×v/L
根據(jù)提取液體積和樣品重量,，即可求出LOX的活力：
LOX(μmol·g﹣1·min﹣1)=R×V/W
式中 V－提取液的體積；
W－樣品鮮重,。