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如何誰(shuí)用SDS裂解法進(jìn)行質(zhì)粒抽取實(shí)驗(yàn)
點(diǎn)擊次數(shù)：1082 發(fā)布時(shí)間：2014-2-24
上海士鋒生物科技有限公司本法[根據(jù)Godson和Vapnek(1973)的方法修訂而成]的產(chǎn)量要低得多,，但卻比本章所述的其他方法更溫和,，是提取大質(zhì)粒(大于15kb)的方法。
試驗(yàn)步驟:
1,、將500ml細(xì)菌沉淀物洗過(guò)后重懸于10ml用冰預(yù)冷的10%蔗糖,、50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)溶液中，將懸液移至30ml的帶蓋螺口塑料試管[橡樹(shù)嶺(Oak Ridge)型]中,。
2,、加入2ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)],。當(dāng)溶液的pH值小于8.0時(shí),，溶菌酶不能有效地發(fā)揮作用。
3,、加8ml 0.25mol/L EDTA(pH8.0),，將管倒置數(shù)次以混勻懸液，在冰上放置10min,。
4,、加4ml 10% SDS，用玻棒迅速混勻內(nèi)容物,，使SDS均勻分散到整個(gè)細(xì)菌懸液中,，操作應(yīng)盡可能溫和小心，以便zui大限度地避免釋放出來(lái)的DNA受到剪切,。
5,、立即加入6ml 5mol/L NaCl(終濃度為1mol/L)，再次用玻棒溫和*地混勻內(nèi)容物,，在冰上放置至少1h,。
6、以4℃【用Beckman Ti50型轉(zhuǎn)頭(或與其相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)頭)】,，30 000rpm離心30min,，小心將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)50ml的一次性塑料離心管中，棄去沉淀物,。如果細(xì)菌碎片未能全部除盡,，可用35 000rpm再離心20min，將上清轉(zhuǎn)移到另一管中,，去掉存在離心管內(nèi)的粘稠狀液體,。
7,、上清分別用酚/氯仿和氯仿各抽提1次,。
8、將水相轉(zhuǎn)移到250ml的離心瓶中,，于室溫加入2倍體積的(約60ml )乙醇,，充分混勻，室溫下放置1-2h。
9,、以4℃,，5000rpm離心20min，回收核酸,。
10,、離心管倒置于紙巾上，使zui后殘存的乙醇流干,，在真空干燥內(nèi)短時(shí)間干燥沉淀物,，但不要使之*干燥。
11,、用3mlTE(pH8.0)溶解DNA,。