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士鋒生物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)步驟、體系及問(wèn)題分析
點(diǎn)擊次數(shù):1116 發(fā)布時(shí)間:2014-2-17
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是分子生物學(xué)常用技術(shù),,是體外擴(kuò)增DNA的方法,,設(shè)計(jì)生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域,基本是進(jìn)了實(shí)驗(yàn)室都必須掌握的技術(shù),。對(duì)于剛?cè)肷镩T(mén)的我們簡(jiǎn)單了解其步驟,、反應(yīng)體系很有必要。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction ,PCR)步驟
<img alt="聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)步驟,、體系及問(wèn)題分析" 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)步驟,、體系及問(wèn)題分析"="" border="1" height="520" data-cke-saved-src="http://www.bio1000.com/uploads/allimg/120606/1A223OE-0.jpg" src="http://www.bio1000.com/uploads/allimg/120606/1A223OE-0.jpg" width="525" style="vertical-align: middle; border: 0px;">
三步:
1 變性:模板DNA加熱變性
2 退火 引物與它的靶序列發(fā)生退火,引物DNA量多,,使引物和模板在局部形成雜交鏈
3 延伸 4種dNTP 與 Mg2+ 存在的條件下,,DNA合成酶催化以引物為起始點(diǎn),,按5'-3'方向進(jìn)行延伸。
上面三步為一個(gè)循環(huán),,可使拷貝數(shù)到達(dá)2*E-6-2*E-7
PCR 產(chǎn)物一段雙鏈DNA,,是由它的末端引物的5’端決定的。
PS:
1.首輪擴(kuò)增,,其產(chǎn)物是大小不均一的DNA分子,。長(zhǎng)度應(yīng)大于兩引物之間的長(zhǎng)度。
在第二個(gè)循環(huán)中,,由于5'固定,,其產(chǎn)物長(zhǎng)度就由等于兩引物之間的長(zhǎng)度。所以幾十個(gè)循環(huán)后就會(huì)產(chǎn)生
大量的兩引物之間序列,。
引物設(shè)計(jì):
1,,長(zhǎng)度15~30個(gè)核苷酸,zui多到50個(gè)核苷酸左右,。
2, 盡量避免嘌呤和嘧啶堆積的現(xiàn)象,。(其實(shí)有時(shí)很難避免,不是很重要),。
3,引物內(nèi)部不應(yīng)該形成二級(jí)結(jié)構(gòu),,如果引物中有酶切位點(diǎn)時(shí),就會(huì)出現(xiàn)引物二聚體,。(一般不是很重要)
PCR的反應(yīng)條件
1,,dNTP濃度過(guò)高會(huì)加快反映速度,但同時(shí)還可以增加堿基的錯(cuò)誤摻入率,。
2,, 引物濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。
3,,TaqDNA聚合酶濃度過(guò)高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增,,低則合成產(chǎn)物量減少。
TaqDNA聚合酶無(wú)校正功能,,摻入錯(cuò)誤率達(dá)2*E-4個(gè)核苷酸,,一個(gè)30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)0.1%-0.25%總錯(cuò)誤率。
4,, 在90~95度下可使整個(gè)基因組的DNA變性為單鏈,。一般94~95度30~60s。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)使
TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多,。
5,,DNA很快冷卻到40~60度使引物和模板結(jié)合。引物長(zhǎng)度在15~25時(shí)退火溫度
Tm=4(G+c)+(A+T),一般在45~55度,,溫度低容易退火但特異性低;溫度高,,不容易退火但特異性高。退火時(shí)間30秒,。
6,,延伸溫度一般在70~75度這是TaqDNA聚合酶活性zui高(150個(gè)/S),當(dāng)引物在16個(gè)堿基以下時(shí)可采用緩慢升高溫度到70~75度的方法,,使在低溫下就開(kāi)始合成,。一般<1KB時(shí)間1分鐘即可。當(dāng)<1KB時(shí)在較后的循環(huán)中延長(zhǎng)擴(kuò)增時(shí)間,。
7循環(huán)次數(shù)25~30次,。
無(wú)產(chǎn)物時(shí)對(duì)策:
1,取10ul擴(kuò)增混合液作模板在進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。
2,,增加TaqDNA聚合酶濃度
3,增加循環(huán)次數(shù)
4,,降低退火溫度
5,,加靶DNA量
PCR時(shí)常會(huì)遇見(jiàn)電泳沒(méi)有條帶,基因片段擴(kuò)增不出來(lái),,zui主要的原因就是引物設(shè)計(jì)不合理,、退火溫度問(wèn)題、DNA中蛋白雜質(zhì)較多,、PCR反應(yīng)體系有漏加的物質(zhì)如dNTP等,。