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士鋒生物APAAP免疫組化實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程
點(diǎn)擊次數(shù)：1047 發(fā)布時(shí)間：2014-1-22
(一) 基本原理
APAAP(Alkaline phosphatase-anti-alkaline phosphatase technique) 技術(shù)的基本原理為: 抗鼠IgG抗體作為橋梁,，將鼠源性識(shí)別細(xì)胞抗原的*抗體與鼠源性的抗堿性磷酸酶單克隆抗體-堿性磷酸酶復(fù)合物相連接,，使之成為Ag，-Ab１－Ab２-anti AP-AP的復(fù)合物,。還可通過(guò)二抗將APAAP 復(fù)合物重復(fù)疊加起來(lái),，從而使多個(gè)堿性磷酸酶標(biāo)記于組織細(xì)胞上*抗體所識(shí)別的抗原部位，提高了敏感性,。
(二) 方法
分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),，洗滌后用含10％FCS犚PMI1640
調(diào)整細(xì)胞濃度約5×10６／ml
↓
自制制片機(jī)上制片，充分干燥
↓
用含丙酮-福爾馬林固定液中固定30秒鐘
↓
自來(lái)水,、蒸餾水依次沖洗
↓
用TBS稀釋特異性McAb或陰性對(duì)照抗體(1∶50～500),，
每片加30～50μl
↓
室溫濕盒孵育30min，或4℃冰箱濕盒中
↓
充分用TBS沖洗后,，加1∶50羊(兔)抗鼠IgG
(GAM或RAM IgG)30～50μl
↓
室溫濕盒孵育30min
↓
TBS沖洗后加堿性磷酸酶-抗堿性磷酸酶(1∶2000)復(fù)合物(APAAP)
↓
TBS沖洗后可重復(fù)疊加GAM或RAM IgG和APAAP2次,，每次孵育10min
↓
沖洗后底物液顯色10～15min
↓
自來(lái)水沖洗，蘇木精襯染,，光鏡下觀察
(三) 試劑器材
載玻片,，制片機(jī)，濕盒,，光學(xué)顯微鏡
1. APAAP配制：牛腸堿性磷酸酶Ⅶ型(Sigma)4.3μl或粗酶2mg溶于1ml 0.05M,PH7.6的TBS,，加抗堿性磷酶單克隆抗體腹水2μl制成，臨用時(shí)作1∶2～1∶4稀釋,。
2. AP底物配制：Naphathol(萘酚)AS-MX(Sigma) 25mg溶于1ml二甲基甲酰胺,，加PH8.2, 0.1M Tris-HCl緩沖液49ml，再加Fast Red ITR (Sigma) 50mg,，充分混勻,，用前配制。必要時(shí)加12mg Levamisole以抑制內(nèi)源性堿性磷酸酶,。亦可按上述比例少量配制,。
3. 丙酮-福爾馬林固定液：4℃保存
100mg Na２HPO４
500mg KH２PO４
150ml H２O
225ml Acetone
125ml Formalin