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士鋒生物非標(biāo)記抗體免疫電鏡實(shí)驗(yàn)技術(shù)
點(diǎn)擊次數(shù)：796 發(fā)布時(shí)間：2014-1-10
(一) 原理
標(biāo)記抗體法雖然具有許多優(yōu)點(diǎn),，但也存在一些難以克服的問題,，如標(biāo)記抗體的分子增大，對(duì)細(xì)胞膜和組織的穿透力減弱;化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)對(duì)抗體和酶的活性有所影響;結(jié)合物中未標(biāo)記的抗體可與抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,，影響檢測(cè)方法的敏感性等,。不標(biāo)記抗體法可以避免上述的不利影響因素，通過一系統(tǒng)的非標(biāo)記抗體的免疫學(xué)反應(yīng),，對(duì)組織中的抗原進(jìn)行定位檢測(cè),。不標(biāo)記抗體法又可分為用標(biāo)記物顯示和不同標(biāo)記物顯示兩種方法。前者利用基因工程方法制備雙特異性抗體的F(ab′)2,，一個(gè)Fab片段與標(biāo)本中的抗原結(jié)合,，一個(gè)Fab是抗體蛋白的結(jié)合片段。在抗體與標(biāo)本作用后,，再加入鐵蛋白與抗體結(jié)合,，從而顯示組織內(nèi)抗原的所在部位。后者則用磷酸鎢負(fù)染后,，直接電鏡觀察,。
(二)材料及試劑
1.待檢病毒材料 如糞便，氣管分泌物,、腦脊髓液,、組織培養(yǎng)液等。
2.高速離心機(jī)
3.已知抗體
4.磷鎢酸
5.瓊脂糖
6.其它
(三)操作方法
1.經(jīng)典法
(1)將被檢病毒材料0.9ml,，加1︰5～1︰10稀釋的特異性免疫血清0.1ml充分混合,。
(2)置37℃作用1h或37℃1h后再置4℃
(3)以17 000r/min～23 000r/min離心90min。
(4)吸去上清,，將離心管口倒置于濾紙上,，吸去殘留液體。
(5)沉淀物中加少量H2O混懸,，用3%磷鎢酸(pH6.0)負(fù)染20Sec～30Sec,，滴加于400目銅網(wǎng)Fomnvar膜上，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣輕輕吸去多余的負(fù)染液,。
(6)在透射電鏡下4×104倍觀察,。
2.快速法(瓊脂擴(kuò)散法)
(1)同經(jīng)典法(1)、(2)步驟,，制備免疫復(fù)合物,。
(2)以生理鹽水或pH 7.2巴比妥緩沖液制備1%瓊脂糖，趁熱澆注于潔凈的載玻片上,，每片3ml,，待冷卻凝固后，在凝膠面上等距離放置直徑4mm玻璃珠數(shù)粒，再于凝膠面上澆注1%瓊脂糖2ml～3ml,，冷卻凝固后,，取出玻璃珠，使凝膠形成凹孔,。
(3)將普通濾紙剪成2×3cm大小,，3～4層重疊。用小刀將帶有凹孔的瓊脂糖切成小塊,每塊帶有一個(gè)凹孔,平放在濾紙上,。
(4)在凹孔內(nèi),，加入制備好的含病毒的免疫復(fù)合物懸液。
(5)將電鏡載網(wǎng)的Fomnvar膜面向下倒懸于液滴上,。由于瓊脂糖的吸水作用,，20min～30min后，可將液滴的水分吸干,，而濃縮的免疫復(fù)合物則粘附在載網(wǎng)膜上,。
(6)在載網(wǎng)膜上滴加3%磷鎢酸負(fù)染20Sec，過量的負(fù)染液用濾紙?jiān)谳d網(wǎng)邊緣輕輕吸去,。
(7)于透射電鏡4×104倍下觀察,。
(四)結(jié)果判定
直接觀察病毒粒子的形態(tài)。由于離心濃縮的處理和特異性抗體的加入,，大大提高了觀察的敏感性,。