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士鋒免疫組化常見問題分析
點擊次數(shù)：1705 發(fā)布時間：2013-7-31
1,、 一抗從4度拿出后,，為什么要進(jìn)行37度復(fù)溫?
（1）一方面，防止切片從4度直接放入PBS易脫片;
（2）另一方面,，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定,。一般不需要，但對表達(dá)較弱的抗原可能有用,，4度和37度時分子運(yùn)動方式不同,，前者分子碰撞機(jī)率和運(yùn)動速度小于后者，后者結(jié)合更快,，但敏感性也提高了并易造成非特異染色,。
（3）其實，我更贊同后一種說法,，因為我嘗試把肝臟或睪丸片子從4度過拿出后,，直接用PBS洗沒發(fā)生過脫片現(xiàn)象。
2,、切片染色后背景太深,，如何區(qū)分特異性與非特異性著色?
全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的強(qiáng)度可深可淺,，總之,，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有：
（1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一,。解決辦法是,，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對其工作濃度進(jìn)行測試，使每一抗體個體化,，找到適合自己實驗室的理想工作濃度,，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡單的按說明書進(jìn)行染色,。
（2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程,，隨身佩帶報時表或報時鐘,，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長?，F(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高,，要求一抗孵育的時間不是傳統(tǒng)的1小時,，而是30分鐘，因此,，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整,。
（3）DAB變質(zhì)和顯色時間太長：DAB現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用,。配制好的DAB不應(yīng)存放時間太長,，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力,，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的,。DAB的顯色在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時立即終止反應(yīng),。不過當(dāng)染色片太多時或用染色機(jī)時,，這樣做似乎不現(xiàn)實，但至少應(yīng)對一些新的或少用的抗體顯色時進(jìn)行監(jiān)控,，避免顯色時間過長,。
（4）組織變干：修復(fù)液溢出后未及時補(bǔ)充液體、染色切片太多,、動作太慢,、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因,。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì),，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失,，也能提高操作速度,。
（5）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時間太長（大于24小時）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在,。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù),，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4ºC冰箱過,，對結(jié)果無明顯影響,，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天,，會出現(xiàn)背景著色,，因此，不可存放時間太長,。
（6）一抗變質(zhì),、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色,。用新買的抗體時設(shè)立陽性對照和用使用過的抗體作比較,。
3,、脫片產(chǎn)生的原因有哪些?
（1）多聚賴氨酸玻片質(zhì)量的問題。我原先是買的,，邁新按說也是不錯的,，可是都脫成什么樣子了。后面補(bǔ)做第二批時用的病理科老師自己做的片子,，要好一點,。
（2）組織切的不好，切片機(jī)的問題例如比較老的舊的機(jī)器切的厚或者不均勻,，或者切片者手法不好等,。
（3）沒烤好，時間短,，溫度不夠之類,。
（4）操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子不甩或輕輕甩,，用衛(wèi)生紙從邊緣上慢慢吸水,。
（5）修復(fù)的問題：抗原修復(fù)的時候高壓時間過長了，或者放進(jìn)100度的修復(fù)液時手法不好,，咚的一聲就丟進(jìn)去了,，這樣超容易脫片。此外,，用EDTA修復(fù)比檸檬酸容易脫片,，但是你要用到EDTA的時候也沒辦法，只有從另外的問題上著手,。
（6）一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹(jǐn)慎,，用PBS的時候盡量用泡的，不要沖,?；旧习堰@些方面都注意到了，能改善的盡量改善,，脫片可以減少很多,。
（7）組織的問題，我用的組織癌癥的很多,，越是癌癥組織有壞死之類越容易脫,。
4、免疫組化中抗原修復(fù)的*條件是什么?（尤其是微波修復(fù)）
關(guān)于抗原修復(fù),，我試過的修復(fù)條件有EDTA熱修復(fù),，檸檬酸鈉為緩沖液的微波修復(fù)以及高壓鍋修復(fù)。從我的實驗結(jié)果來看，微波修復(fù)其實很不容易掉片子的,，而EDTA熱修復(fù)和高壓鍋修復(fù)是很容易掉片子的。因為掉片子主要是因為加熱過程中產(chǎn)生的氣泡所引起,，而微波修復(fù)水加熱到沸騰,，沾在片子上的氣泡就會少，不會因為小氣泡上串引起脫片,。做EDTA修復(fù)時,，你可以將片子靠的盡量近些，或是在載玻片四周墊些棉花什么的,，然后蓋上蓋玻片,，這樣修復(fù)的話就能夠盡量減少載玻片上小氣泡的形成。我們用的微波修復(fù)條件為：2.94g檸檬酸三鈉溶于1000ml的水,，調(diào)PH值至6.0,，微波修復(fù)10分鐘。你可以試試,，時間可以根據(jù)需要自己調(diào)整,。對于檸檬酸修復(fù)來說，只要高壓修復(fù)時間控制在加閥冒氣后90秒,，冷水下終止開高壓鍋蓋,，高壓修復(fù)和微波修復(fù)一樣不掉片子，而且一般高壓修復(fù)效果往往更好一點;關(guān)于EDTA熱修復(fù),，一般說明書上都講的是PH值等于9,，實際上我試過，如果單傳用EDTA,，很容易掉片子,，但是用Tris-EDTA,一般就不會掉片子了，Tris-base的濃度為0.05mmol/L,高壓和微波修復(fù)都可以,，PH也等于9,。
5、DAB顯色后發(fā)現(xiàn)切片著色不均勻：如一片著色,，一片不著色或染色淺?
著色不均勻可能與你的實驗手法有很大關(guān)系,，可能原因有：
（1）切出的片子厚度本身可能就不一樣，切出一片厚,，一片薄,，這樣可能造成著色深淺不一。
（2）有可能是你的顯色液底物加到片子上后沒有搖勻,，造成局部底物濃度不一致,，所以加完顯色液后將片子來回左右晃動幾下，使片子上所有區(qū)域的底物濃度一致。
（3）如果你的片子是中間的染色深,，靠近邊上的淺,，那有可能是你蠟圈畫的太小，顯色液覆蓋的面積不過大而產(chǎn)生了邊緣效應(yīng),。zui外側(cè)的組織片離顯色液外緣0.5cm,。