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免疫酶法是借助酶細(xì)胞化學(xué)等手段顯示組織抗原（或抗體）的新技術(shù),，是在免疫熒光法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,。免疫酶法的基本原理與免疫熒光法有所相似，免疫酶法是將酶以共價(jià)鍵的形式結(jié)合在抗體上,，制成酶標(biāo)抗體,，再借助酶對底物的特異催化作用,，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒,，于光鏡或電鏡下進(jìn)行細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)部各種抗原成分的定位,。已如前述,，免疫熒光法具有操作簡便,、靈敏、特異性高,、省時(shí)的優(yōu)勢，但同時(shí)也具有令人遺憾的不足,，特別是熒光標(biāo)本不能長期保存以及需要價(jià)格昂貴的熒光顯微鏡才能觀察的問題,。為此，Nakane等人（1966）嘗試了用酶代替熒光素來標(biāo)記抗體的方法,，從而成功地開創(chuàng)了酶標(biāo)記抗體的新技術(shù)（酶標(biāo)抗體法）,。Sternbenger等人又將非標(biāo)記抗體過氧化物酶法成功地引人,，使免疫酶法有了很大的進(jìn)步,，成為當(dāng)今使用的免疫組織化學(xué)技術(shù),。

免疫酶法與免疫熒光法相比較,，具有以下優(yōu)點(diǎn)：酶反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)的顏色不僅能在一般的普通生物顯微鏡下觀察,，而且其產(chǎn)物因具有一定的電子密度也可在電鏡下觀察（免疫電鏡技術(shù)）,，光鏡與電鏡的結(jié)合，使靈敏度進(jìn)一步提高,，標(biāo)本又能長期保存，并能加設(shè)HE染色等其他復(fù)染,，有利于將被檢測物質(zhì)與病變的形態(tài)學(xué)改變起來（定性與定位）,，彌補(bǔ)了免疫熒光法的不足,。

從理論上講，用細(xì)胞化學(xué)方法能顯示的酶，均可用于標(biāo)記抗體進(jìn)行免疫酶法染色,，但實(shí)際上能用于免疫組織化學(xué)技術(shù)的酶并不多。sternbenger等人指出：用于標(biāo)記的酶應(yīng)具備以下六點(diǎn)：

1） 酶催化的底物必需是特異的，而且容易被顯示,，即催化反應(yīng)所形成的產(chǎn)物易于 在光鏡和電鏡下觀察,。

2） 酶反應(yīng)的終產(chǎn)物所形成的沉淀必須穩(wěn)定，即終產(chǎn)物不能從酶活性部位向周圍組織彌散,，而影響組織學(xué)定位,。

3） 較易獲得純的酶分子,。

4） 中性PH值時(shí),，酶分子應(yīng)穩(wěn)定,。

5） 在酶標(biāo)過程中,，酶連接在抗體上,，不能影響二者的活性,。

6） 被檢組織中,，不應(yīng)存在與標(biāo)記酶相同的內(nèi)源性酶或類似的物質(zhì),，否則結(jié)果將難以判定,。

上述六點(diǎn)中以1.2兩點(diǎn)zui為重要,，因?yàn)椴⒎撬械娜菀罪@示的酶均能形成不溶性的復(fù)合物。符合上述要求的,，zui為常用的酶是辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase,，H：：flJ）。其次是堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase,，AKP）,，除此兩種外，還有葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase,，GOD）等,，但因其形成的不溶性色素?cái)U(kuò)散作用較大，在應(yīng)用上受到很大限制。 HRP廣泛分布于植物界,，因其辣根含量zui高而得名,。它是由無色酶蛋白和深棕色的鐵葉結(jié)合組成的一種糖蛋白（糖占18%左右），分子量為40000道爾頓,，等電點(diǎn)3~9,，zui適 PH為 5.0左右。HRP易溶于水和58%以下的飽和硫酸鉸溶液,，其活性部分為鐵葉琳,，稱輔基。酶的蛋白部分無活性,。酶蛋白和鐵葉琳輔基的zui大吸收光譜分別為275urn和403urn;HRP的純度用兩者的光密度比值（M03人工衛(wèi)75）來衡量,，以RZ（Reinheitzahi）來表示。一般認(rèn)為,，標(biāo)記酶的RZ值為 3.0左右,，不應(yīng)<2.8，RZ值越小,，酶的純度越差,，對于純度低，質(zhì)量差的酶,，需經(jīng)純化后才能使用,。

AKP是一種磷酸酶的水解酶，磷酸單酯酶對于連接于作用物磷酸基上的醇基沒有特異性,，因它可以水解多種有機(jī)磷酸酯,，生成醇和磷酸鹽離子。該酶在許多人體組織或動物組織中有分布,，如肝,、胎盤、白細(xì)胞,、腎,、小腸等。AKP的分子量為80KD,，zui適PH為9.8,，其活性受底物及濃度、緩沖液及其離子濃度等因素影響,，如用二乙醇胺緩沖液（1mol/L,，PH9.8）對AICI’具有活化作用，酶的活性高,，而用甘氨酸一NaOH緩沖液則對AKP有抑制作用,。AKP的活化劑有鎂和錳離子,，Mg++的適應(yīng)濃度為10mol/L。甘氨酸,、檸檬酸鹽,，EDTA等對 AKP有抑制作用。AKP對溫度具有較高的敏感性,，從 25℃增加到 35℃,，其催化反應(yīng)速度增加 1.5倍。當(dāng)選用不同的底物時(shí),，AKP可催化形成不同顏色的終產(chǎn)物。例如,，萘酚一AS一MX和快藍(lán)（Fast blue,，F(xiàn)h）為底物時(shí)生成藍(lán)色產(chǎn)物，可與HRP催化的產(chǎn)物形成鮮明的對比,，用快紅（Fast red）代替快藍(lán)則生成紅色不溶性產(chǎn)物,，而且內(nèi)源性AKP較易清除，可以較好地避免內(nèi)源性酶的干擾,，使其具備了某些*的優(yōu)點(diǎn)而日益?zhèn)涫苤匾暋?/u>

GOD所催化的底物為葡萄糖,，電子供體為對硝基藍(lán)四隆（Paranitroblue Tetrazolium）,，終產(chǎn)物比較穩(wěn)定,，為不溶性的藍(lán)色沉淀。從理論上講,，GOD較AKP和HRP為佳,，因?yàn)?u>哺乳動物組織內(nèi)不存在內(nèi)源性葡萄糖氧化酶，這樣可以很好地避免內(nèi)源性酶的干擾,。但是,，GOD的分子較HRP大三倍，具有較多的氨基,，在標(biāo)記時(shí)易形成廣泛的聚合,，而影響酶的活性。

免疫酶法與免疫熒光法大致相同,，也可以分為以下幾種,。

（1）直接法

用酶標(biāo)記的特異性抗體直接與標(biāo)本中的相應(yīng)抗原反應(yīng)結(jié)合，再與酶的底物作用產(chǎn)生有色的產(chǎn)物,，沉積在抗原抗體反應(yīng)的部位,，即可對抗原進(jìn)行定性、定位以至定量研究,。

直接法的*步是特異的——即酶催化底物的反應(yīng),，其余步驟則是非特異的,，可用各種電子供體介導(dǎo)。以HRP為例,，HRP的底物是巴H2O2,，在分解已過程中，與H2O2形成初級復(fù)合物,，無電子供體存在時(shí),，反應(yīng)不再繼續(xù)進(jìn)行，當(dāng)電子供體存在時(shí),，反應(yīng)以一定的速度形成第二種復(fù)合物,，繼之HRP催化H2O2所形成的中間型產(chǎn)物，迅速生成水,，酶被還原,，電子供氫體被氧化，聚合,，再經(jīng)氧化環(huán)化,，zui后形成引哚胺多聚體，于酶反應(yīng)部位,，形成不溶性棕褐色沉淀,，與組織對比清晰，達(dá)到定位,、定性,、定量的目的。

直接法簡便,、快速,、特異性強(qiáng)，非特異性背景反應(yīng)低,。其缺點(diǎn)是,，每種抗原必須分別用其抗體的酶標(biāo)記物，且敏感性較間接法低,。

（2）間接法

間接法是先用未標(biāo)記的特異性抗體（一抗）與標(biāo)本中相應(yīng)抗原反應(yīng),，再用抗特異性抗的酶標(biāo)記抗體與結(jié)合在抗原上的一抗（即特異性抗體）反應(yīng)。例如,，*次使用的特異性抗體（一抗）是由家兔產(chǎn)生的,，則第二次使用的抗體（二抗）必須是酶標(biāo)記的抗兔的免疫球蛋白，常用的羊抗兔lgG的酶標(biāo)記物（即酶標(biāo)羊抗兔IgG）,。然后與直接法相同,，與底物反應(yīng)、顯色,、將抗原的性質(zhì),，部位和含量檢測出來,。

間接法的優(yōu)點(diǎn)是用一種酶標(biāo)抗體就可與多種特異性一抗配合而檢查多種抗原，而且敏感性也優(yōu)于直接法,。

（3）酶橋法

酶橋法的建立是免疫酶法重大改進(jìn)的標(biāo)志,。將用化學(xué)交聯(lián)法將酶與抗體分子結(jié)合的技術(shù)改進(jìn)為用酶和酶抗體免疫反應(yīng)而結(jié)合的方法，避免了由于化學(xué)反應(yīng)過程中對酶活性和抗體效價(jià)的不良影響,。其基本原理是用酶免疫動物,，制備價(jià)、特異性強(qiáng)的抗酶抗體,，然后用第二抗體作橋,，將抗酶抗體和特異性的*抗體（即連結(jié)在組織抗原上的抗體）連接起來，再將酶結(jié)合在抗酶抗體上,，經(jīng)過酶催化底物的顯色反應(yīng)后,，顯示出抗原所在的部位及含量。作為橋的第二抗體（即橋抗）必須對特異性抗體（一抗）和酶抗體都具有特異 性,，這樣才能將二者相連起來，因此,，一抗和酶抗體應(yīng)由同一種屬動物產(chǎn)生,。例如，特異性抗體和酶抗體都是兔產(chǎn)生的,，再用羊抗兔IgG作為橋抗體就能將兩者連接起來,。在此 過程中，由于任何抗體均未被酶標(biāo)記,，酶是通過免疫學(xué)原理與抗酶抗體結(jié)合的,，避免了共價(jià)連接對酶活性的影響，提高了方法的敏感性,，同時(shí)也節(jié)省了特異性抗體（即一抗）的用量,。

酶橋法雖然克服酶標(biāo)記抗體法的缺點(diǎn)，較好地保護(hù)了抗體和酶的活性,，但是仍存在不足,，其主要表現(xiàn)為①在抗酶抗體的抗血清中，含有低親和力和高親和力兩類抗體,，它們作為抗原與抗體結(jié)合,，主要依賴于橋抗體對它的親和力，而與其本身對酶的親和力無關(guān),，故兩者均可被連接在橋抗體上,，由于低親和力的抗酶抗體與酶結(jié)合較弱，漂洗時(shí)易解離,，使部分酶丟失,，從而降低了方法的敏感性,。②抗酶抗體血清中，亦含有非特異性抗體,，其抗原性與抗酶抗體相同,，所以能與橋抗體結(jié)合，但卻不能與酶結(jié)合,，這樣影響了組織抗原的顯示,。為解決這些不足，70年代初,，Sternberg在各種標(biāo)記抗體法和酶橋法的基礎(chǔ)上,，建立了PAP法，并加以改良,，成為應(yīng)用的免疫組織化學(xué)技術(shù)之一,。

（4）PAP法

PAP法是酶橋法等基礎(chǔ)之上建立的，其基本原理與酶橋法相似,，都是利用橋抗體將 酶連接在*抗體結(jié)合的部位,，所不同的是，將酶和抗酶抗體制成復(fù)合物（PAP）以代替酶橋法中的抗酶抗體和隨后結(jié)合的酶,，將兩個(gè)步驟合并為一個(gè)步驟,，這一重要的改進(jìn)，不僅僅是簡化步驟,，而具有更大的優(yōu)勢,，因?yàn)镻AP是由3個(gè)過氧化物酶分子和2個(gè)抗酶抗體分子結(jié)合形成的一個(gè)環(huán)形分子，排列呈五角形結(jié)構(gòu),，3個(gè)角辣根過氧化酶（HRP）,，另2個(gè)角為抗HRP抗體，其分子量為400,，000~430,，000道爾頓，直徑約為20.5nm,，這種結(jié)構(gòu)異常穩(wěn)定,，沖洗時(shí)酶分子不會脫落，從而大大提高了敏感性,，Petrali等報(bào)告,，PAP法比酶橋法靈敏度高20倍。有人認(rèn)為是免疫熒光法的100~1000倍,。

PAP法應(yīng)用廣泛,，其主要優(yōu)點(diǎn)為：

1） zui大限度地保存了抗體活性。

因?yàn)樵谒械姆磻?yīng)過程中,，任何抗體均未被酶標(biāo)記,，避免了標(biāo)記過程中對抗體活性的損害,。

2） 靈敏度高。

由于是多層抗原抗體反應(yīng),，由于免疫放大作用,，使得結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的酶分子增多，并且PAP法復(fù)合物性質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,，這樣與酶底物反應(yīng)后的呈色反應(yīng)增強(qiáng),，使微量的或抗原性弱的抗原顯示出來，提高了靈敏度,。

3） 背景淡,。

酶橋法中，酶標(biāo)記的非特異性抗體可與組織抗原結(jié)合,，引起背景染色,，給結(jié)果判斷帶來了很大的困難。

PAP法中,，連接抗體中即使存在著非特異性抗體,，因其不是抗IgG的特異性抗體，故不能與抗HRP抗體相結(jié)合,，也就不能把PAP復(fù)合物連接在非特異性抗體上,。當(dāng)然PAP復(fù)合物內(nèi)也可存在一些非HRP特異性抗體，假如這部分抗體能夠與橋抗體及組織成分相結(jié)合,，但因其不是抗HRP抗體，所以不能與HRP結(jié)合,，也就無酶活性及背景染色,。背景越淡，當(dāng)然越有利于結(jié)果的判斷,。

PAP法的不足之處是PAP的制備較為復(fù)雜,。

雙PAP法又稱雙橋法（double bridged technique），是PAP法的重要改進(jìn),，通過兩次連接橋抗體和PAP,，在抗原抗體復(fù)合物上結(jié)合了比PAP法更多的酶分子，可提高敏感性達(dá)20~50倍,。一般認(rèn)為,，雙PAP法通過下述途徑來提高敏感性，①重復(fù)的橋抗體與PAP中的抗HRP抗體的抗原未飽和位置結(jié)合,，再連接PAP復(fù)合物,，即在抗原之處，抗體間形成更大的抗原抗體復(fù)合物,，具有多個(gè)酶分子,，使免疫染色增強(qiáng),。②重復(fù)的橋抗體，與特異性的*抗體未飽和抗原相結(jié)合,，使*抗體上結(jié)合較多的橋抗體和PAP復(fù)合物,，起到放大作用。雙PAP法的不足之處是步驟多,，需時(shí)長,，在實(shí)際操作中，可能會帶來非特異性放大的問題而影響結(jié)果的判斷,。

（5）APAAP法

APAAP——堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase antialkaline phosphatase, APAAP）法是Mason和Moir（1983）等在PAP法的基礎(chǔ)上,，用AKP替代HRP而建立的一種方法，都屬于未標(biāo)記抗體橋聯(lián)法,。APAAP法與PAP一樣,，利用橋抗體將AKP連接在*抗體的結(jié)合部位，而AKP和抗AKP抗體被制成復(fù)合物（APAAP）,，通過APAAP復(fù)合物中的AKP催化底物顯色以顯示抗原物質(zhì),。

APAAP法的主要優(yōu)點(diǎn)：

1） 在內(nèi)源性的過氧化物酶較高的組織中進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色時(shí)，APAAP法較PAP法具有更多的優(yōu)勢,，僅需稍加處理就能消除內(nèi)源性酶的干擾,，而PAP法則困難較大。

2） 敏感性與PAP法大致相似,。

3） 在血,、骨髓、脫落細(xì)胞涂片的免疫細(xì)胞化學(xué)染色上具有PAP法不能替代的優(yōu)勢,。

4） 反應(yīng)穩(wěn)定,，著色清楚，背景淡,。

免疫酶法分為直接法,、間接法、酶橋法,、PAP法和APAAP法,。其中的PAP法和APAAP法應(yīng)用較為廣泛，不過PAP的制備較為復(fù)雜,，而APAAP法建立在PAP法的基礎(chǔ)上,，能有效彌補(bǔ)PAP法的不足。