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如何用elisa方法進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)染色
點(diǎn)擊次數(shù)：2199 發(fā)布時(shí)間：2013-7-23
一,、材料和試劑
1、玻片：須用免疫組化玻片,，或用2%多聚賴氨酸包被處理玻片,。
2、5-10%正常山羊血清封閉液,，用PBS配,。
3、3%牛血清白蛋白（BSA）,，用PBS配,。
4、0.01M pH7.4 PBS
5,、1% BSA-PBS（含0.05% Tween20）
6,、AEC底物
（1）底物緩沖液（20X） PH 4.6
醋酸（分子量60.6） 30.6ml
Triton X-100
醋酸鈉 3H2O（分子量136.1）66.68克
加蒸餾水到960ml，調(diào)pH到4.6,，zui后加蒸餾水到總體積1000ml,。
（2）AEC（20X）
AEC 15mg/ml，溶在DMF（二甲基甲酰胺,，分子式HCOH（CH3）2 分子量73.10中）
（3）0.6% H2O2（20X）
臨用時(shí),，（1）（2）（3）各50ul，在1ml雙蒸餾水中混勻30分鐘內(nèi)有效,。
7,、DAB（即DAB-4HCL）
（1）1.5克DAB在100ml水溶液中（20X）
（2）1M Tris（20X），用HCl調(diào)PH到7.4
（1）（2）（3）各滴加入1ml二蒸水中,，新鮮配,，避光，30分鐘內(nèi)有效,。溶解后（可加熱到50℃）,，加水合氯醛50克（水合氯醛Chloral Hyclrate,，分子量165.4），枸櫞酸1克,，充分溶解,，于棕色瓶中，室溫或400C保存,。
8,、蘇木素復(fù)染液
蘇木素 1克
碘酸鈉 0.2克
鉀礬 50克
水 1000ml
9、含10%及2%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液,。
10、3% H2O2：30%H2O21份,，加9份雙蒸水,，臨用時(shí)配。
11,、細(xì)胞抗原玻片及96孔細(xì)胞抗原板
12,、封片液：1克明膠，溶于30ml 35℃水中,，加入35ml甘油（或用甘油封片）和650mg石碳酸（先溶于0.6ml水中）,。
二、細(xì)胞內(nèi)源過氧化物酶阻斷（使用HRP標(biāo)記二抗或SP法時(shí)必須阻斷）
1,、從冰箱取出細(xì)胞片或細(xì)胞板,，置室溫或37℃ 10-15分鐘，使恢復(fù)溫度,。
2,、加3% H2O2，細(xì)胞片20ul/孔,，培養(yǎng)板100ul/孔,，使充分覆蓋住細(xì)胞。
3,、室溫10分鐘后,，甩掉 H2O2，用PBS輕輕淋洗2分鐘,。用濾紙吸干細(xì)胞周圍水份,，96孔在濾水紙上扣干，但注意保持細(xì)胞濕潤,。
三,、封閉
細(xì)胞片用5-10%正常山羊血清（20ml/孔），細(xì)胞板用2-5%BSA（PBS配制）100ul/孔,，置37℃孵育30分鐘后甩掉封閉液,，不洗,。
四、免疫化學(xué)染色
1,、分別加一抗和所有對照一抗,，細(xì)胞法10-20ul/孔，細(xì)胞板50ul/孔,，使充分覆蓋細(xì)胞,。37℃1小時(shí)或4℃冰箱過;
2、棄去一抗,，如為細(xì)胞涂片用PBST輕輕簡單淋洗1次后,，浸于100 mL含PBST洗杯，漂洗（在慢速搖床上）3-5分鐘,，轉(zhuǎn)入第二杯PBS（100 ml）,，如上法漂洗3-5分鐘。擦干細(xì)胞片周圍水分,，96孔板則倒掉一抗后,，每孔加滿PBST在搖床上搖洗3-5分鐘后倒掉，在濾紙上扣干,，但保持細(xì)胞濕潤,，反復(fù)3-4次;
3、加SP試劑（SP法,，即放大法）
（1）加已優(yōu)選好的濃度的Biotin標(biāo)記二抗,，細(xì)胞片10ul/孔，細(xì)胞板50ul/孔,，使充分復(fù)蓋細(xì)胞,。37℃孵育30分鐘;
（2）按免疫化學(xué)染色“2”所述方法洗滌和擦干;
（3）加已優(yōu)選好濃度的SP試劑，用量同“（1）”,，37℃孵育30分鐘后按免疫化學(xué)染色“2”法洗滌及擦干;
4,、間接法加二抗（不放大法）
方法同SP法，但不用Biotin標(biāo)記二抗,，而改用HRP直接標(biāo)記二抗,。并省略（3）步驟;
5、加底物顯色
（1）加足量的AEC顯色液,，充分覆蓋細(xì)胞層,，細(xì)胞玻片20ul/孔，細(xì)胞培養(yǎng)板50ul/孔,，置于37℃恒溫箱孵育5-10分鐘,，一般在顯微鏡下根據(jù)結(jié)果顏色的呈現(xiàn)情況掌握染色時(shí)間，以得到滿意的結(jié)果（陽性對照顯色程度為“+++” ），用自來水即可終止反應(yīng);
（2）復(fù)染：蘇木素染液（使用時(shí)間不超過兩個(gè)月）加蘇木素復(fù)染液1-2滴,，1分鐘左右,，在自來水下輕輕沖洗掉蘇木素，再浸于PBS中約30秒鐘返藍(lán),，zui后在蒸餾水中漂洗,。
6、封片
洗后細(xì)胞片擦去周圍水分,，滴加1滴甘油—明膠封片液,，加蓋玻片，除去氣泡,，用指甲油或樹膠封固玻片,。
五、結(jié)果判斷
陽性——誘導(dǎo)細(xì)胞有10%-30%顯紅色,，強(qiáng)度不一,，未誘導(dǎo)陽性細(xì)胞（1-30%）;陰性——誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)BCBL-1細(xì)胞*不顯色（排除邊緣效應(yīng)）
六、注意事項(xiàng)
1,、一抗、二抗的稀釋采用1% BSA/PBS,，Sterptavidin-HRP的稀釋采用PBS;
2,、整個(gè)反應(yīng)過程在濕盒中進(jìn)行（細(xì)胞片）;
3、洗滌時(shí)應(yīng)使用染色缸（細(xì)胞片）;
4,、對照系統(tǒng),，必須要做的對照系統(tǒng)：陽性對照：標(biāo)準(zhǔn)一抗，陽性血清,，陽性上清;陰性對照：（1）陰性一抗對照：小鼠免疫前血清,、測上清時(shí)用原克隆上清液;（2）陰性抗原細(xì)胞對照：未感染病毒的細(xì)胞，每個(gè)待測及對照均須做陰性細(xì)胞對照：空白對照：不加一抗,，用1%BSA替代;無關(guān)對照：與本項(xiàng)目無的*抗體,。