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士鋒科技如何進(jìn)行酶標(biāo)記抗體制備
點(diǎn)擊次數(shù)：1660 發(fā)布時(shí)間：2013-7-19
酶標(biāo)記物包括酶標(biāo)記抗原、酶標(biāo)記抗體和酶標(biāo)記SPA等,。酶標(biāo)記物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否,，因此被稱(chēng)為關(guān)鍵的試劑。酶標(biāo)記物中zui常用的是酶標(biāo)記抗體,，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當(dāng)方法連接而成,。酶標(biāo)記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強(qiáng)及親和力高的酶和抗體,，其次要有良好的制備方法,。目前，高質(zhì)量的酶（如辣根過(guò)氧化物酶,，簡(jiǎn)稱(chēng)HRP）國(guó)內(nèi)已有商品供應(yīng),。高質(zhì)量的抗體則可通過(guò)提取純化而獲得。在制備方法上,，宜選用產(chǎn)率高,、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡(jiǎn)便易行的方法。
（一） 酶制劑及其底物
凡無(wú)毒性又能呈現(xiàn)有色化學(xué)反應(yīng)的酶,，原則上均可作為標(biāo)記用,。但作為標(biāo)記抗體用的酶應(yīng)滿(mǎn)足下列要求：（1）來(lái)源方便，易于純化;（2）比活性高,，性質(zhì)穩(wěn)定;（3）酶活性和量能用簡(jiǎn)單方法測(cè)定,。目前在免疫酶技術(shù)中常用的酶為辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和鹼性磷酸酶（AP），其次還有葡萄糖氧化酶,，β-半乳糖苷酶,、溶菌酶和蘋(píng)果酸脫氫酶等。
由于辣根過(guò)氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）比活性高,，穩(wěn)定,，分子量小，純酶容易制備,，所以zui常用,。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高,，它是由無(wú)色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白,，糖含量18%。HRP由多個(gè)同功酶組成,，分子量為40,000,等電點(diǎn)為PH3～9,酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異,，但多在PH5左右,。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm,，一般以O(shè)D403nm /OD275nm的比值RZ（德文Reinheit Zahl）表示酶的純度。高純度的酶RZ值應(yīng)在3.0左右（zui高可達(dá)3.4）,。RZ值越小,，非酶蛋白就越多。值得注意的是,，純度并不表示酶活性,，如當(dāng)酶變性后，RZ值仍可不變,。
HRP的催化反應(yīng)需要底物過(guò)氧化氫（H2O2）和供氫體（DH2）,。供氫體多為無(wú)色的還原型染料，通過(guò)反應(yīng)可生成有色的氧化型染料（D）,。酶促反應(yīng)的過(guò)程如下:
HRP
DH2+H2O2────→D+2H2O
供氫體的種類(lèi)很多,，形成的產(chǎn)物特點(diǎn)不一。如DAB（3.3-二氨基聯(lián)苯胺）的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物,，并有電子密度,，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀(guān)察。S（5-氨基水楊酸）早期曾用于ELISA,，但其溶解度不夠大,，且空白孔不易控制到無(wú)色，現(xiàn)已很少應(yīng)用,。OT（鄰聯(lián)甲苯胺）的特點(diǎn)是能產(chǎn)生鮮艷的藍(lán)綠色產(chǎn)物且靈敏度較高,，但反應(yīng)中受溫度影響較大，而且由于產(chǎn)物不穩(wěn)定,，需要在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行測(cè)定,。目前用得較廣泛和較滿(mǎn)意的供氫體是：OPD（鄰苯二胺）和TMB（四甲基聯(lián)苯胺）。前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色,，后者產(chǎn)物為藍(lán)綠色,，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定,，空白可近于無(wú)色,，靈敏度上據(jù)報(bào)道后者比前者可高4倍以上。另外,，還有一種供氫體稱(chēng)ABTS