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士鋒科技淋巴細(xì)胞雜交瘤單克隆抗體制備方法
點擊次數(shù)：1878 發(fā)布時間：2013-7-18
制備單克隆抗體包括動物免疫、細(xì)胞融合,、選擇雜交瘤,、檢測抗體、雜交瘤細(xì)胞的克隆化,、凍存以及單克隆抗體的大量生產(chǎn),，要經(jīng)過幾個月的一系列實驗步驟，下面按照制備單克隆抗體的流程順序,，逐一介紹其實驗方法,。
一、細(xì)胞融合前準(zhǔn)備
（一） 免疫方案
選擇合適的免疫方案對于細(xì)胞融合雜交的成功,，獲得高質(zhì)量的McAb至關(guān)重要,。一般要在融合前兩個月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定,。
1. 顆粒性抗原免疫性較強,，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細(xì)胞性抗原為例的免疫方案:
初次免疫 1×10７／0.5ml ip （腹腔內(nèi)注射）
↓ 2～3周后
第二次免疫 1×10７／0.5ml ip
↓ 3周后
加強免疫（融合前三天） 1×10７／0.5ml ip或iv（靜脈內(nèi)注射）
↓
取脾融合
2. 可溶性抗原免疫原性弱,，一般要加佐劑,，常用佐劑：福氏*佐劑，福氏不*佐劑,。要求抗原和佐劑等體積混合在一起,，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴散呈小滴狀表明已達(dá)到油包水的狀態(tài)。商品化福氏*佐劑在使用前須振搖,，使沉淀的分枝桿菌充分混勻,。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏*佐劑皮下多點注射
│ （一般0.8～1ml 0.2ml／點）
↓3周后
第二次免疫 劑量同上,，加福氏不*佐劑皮下或ip
│ ?。╥p劑量不宜超過0.5ml）
↓3周后
第三次免疫 劑量同上，不加佐劑,，ip
│ （5～7天后采血測其效價,，檢測免疫效果）
↓2～3周后
加強免疫，劑量50～500μg為宜,，ip或iv
↓3天后
取脾融合
取脾融合
目前,，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如①將可溶性抗原顆?；蚬滔嗷?，一方面增強了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量,。②改變抗原注入的途徑,，基礎(chǔ)免疫可直接采用脾內(nèi)注射。③使用細(xì)胞因子作為佐劑,，提高機體的免疫應(yīng)答水平,，促進(jìn)免疫細(xì)胞對抗原反應(yīng)性。
（二） 飼養(yǎng)細(xì)胞
在制備單克隆抗體過程中,，許多環(huán)節(jié)需要加飼養(yǎng)細(xì)胞,，如：在雜交瘤細(xì)胞篩選、克隆化和擴大培養(yǎng)過程中,，加入飼養(yǎng)細(xì)胞是十分必要的,。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔巨噬細(xì)胞（較為常用）、小鼠脾臟細(xì)胞或小鼠胸腺細(xì)胞,，也有人用小鼠成纖維細(xì)胞系3T3經(jīng)放射線照射后作為飼養(yǎng)細(xì)胞,，使用比較方便，照射后可放入液氮罐長期保存,，隨用隨復(fù)蘇,。