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上海士鋒生物關(guān)于無血清培養(yǎng)基及其使用方法概述
點擊次數(shù)：1322 發(fā)布時間：2013-5-10
無血清培養(yǎng)基是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基,。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分,。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的*培養(yǎng)基可以滿足大部分細(xì)胞培養(yǎng)的要求，但對有些實驗卻不適合,，如觀察一種生長因子對某種細(xì)胞的作用,，這時需要排除其他生長因子的干擾作用。而血清中可能含有各種生長因子;又如需要測定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過程中分泌某種物質(zhì)的能力;或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞,，以獲得它們的分泌產(chǎn)物,。因此研制出無血清培養(yǎng)基一直是生物科學(xué)工作者努力的目標(biāo)。
無血清培養(yǎng)基的基本配方
基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分,。用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時,，多數(shù)呈貼壁生長或兼性貼壁生長;而當(dāng)其在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中生長時,，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白,、層粘連蛋白、膠原,、玻表粘連蛋白,，細(xì)胞往往以懸浮形式生長。
添加組分包括以下幾大類物質(zhì)：
（1）促貼壁物質(zhì)：許多細(xì)胞必須貼壁才能生長,，這種情況下無血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴展因子,，一般為細(xì)胞外基質(zhì),，如纖連蛋白、層粘連蛋白等,。它們還是重要的分裂素以及維持正常細(xì)胞功能的分化因子,，對許多細(xì)胞的繁殖和分化，起著重要作用,。纖連蛋白主要促進(jìn)來自中胚層細(xì)胞的貼壁與分化,，這些細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞,、粒細(xì)胞,、腎上皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞,、CHO細(xì)胞,、成肌細(xì)胞等。
（2）促生長因子及激素：針對不同細(xì)胞添加不同的生長因子,。激素也是刺激細(xì)胞生長,、維持細(xì)胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細(xì)胞*的,，如胰島素,。
（3）酶抑制劑：培養(yǎng)貼壁生長的細(xì)胞，需要用胰酶消化傳代,，在無血清培養(yǎng)基中*須含酶抑制劑,，以終止酶的消化作用，達(dá)到保護細(xì)胞的目的,。zui常用的是大豆胰酶;抑制劑,。
（4）結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白：常見如轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大,，可增加培養(yǎng)基的粘度,，保護細(xì)胞免受機械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白,。
（5）微量元素：硒是zui常見的,。
使用方法
目前，血清仍是動物細(xì)胞培養(yǎng)中zui基本的的添加物,，尤其是在原代培養(yǎng)或者細(xì)胞生長狀況不良時,，常常會先使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長旺盛以后,，再換成無血清培養(yǎng)液,。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個適應(yīng)過程，一般要逐步降低血清濃度,，從10%減少到5%,，3%,，1%，直至無血清培養(yǎng),。在降低過程中要注意觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化,，是否有部分細(xì)胞死亡，存活細(xì)胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等,。在實驗后這些細(xì)胞一般不再繼續(xù)保留,，很少有細(xì)胞能夠長期培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)之前,，要留有種子細(xì)胞,，種子細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細(xì)胞的特性不發(fā)生變化,。
為了使細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng),，關(guān)鍵的是使所培養(yǎng)細(xì)胞：
●處于對數(shù)生長中期
●>90% 活細(xì)胞率
●適應(yīng)時以較高的起始細(xì)胞接種
有兩種方法使細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基：
1. 直接適應(yīng)——細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基中。
一些類型細(xì)胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應(yīng)無血清培養(yǎng)基,。對于直接適應(yīng),，接種細(xì)胞密度應(yīng)該:2.5×105~3.5×105細(xì)胞/ml。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106~3×106細(xì)胞/ml時,，傳代培養(yǎng)細(xì)胞,。當(dāng)細(xì)胞密度在培養(yǎng)4到7天后達(dá)到2×106~4×106細(xì)胞/ml時，細(xì)胞*適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基,。每隔3~5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106~3×106細(xì)胞/ml,，細(xì)胞活率在90%時,，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。
2. 連續(xù)適應(yīng)——分好幾步把細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中,，與直接適應(yīng)相比較,，連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩?xì)胞更加溫和一些。
●以2倍正常接種密度接種生長活躍的細(xì)胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基：25%SFM 混合培養(yǎng)基中,，傳代培養(yǎng),。
●當(dāng)細(xì)胞密度>5×105細(xì)胞/ml時，以2×105到3×105細(xì)胞/ml細(xì)胞密度,，在有血清培養(yǎng)基：SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng),。
●以2×106到3×106細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，25%有血清培養(yǎng)基和75% SFM中傳代培養(yǎng),。
●當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106到3×106細(xì)胞/ml（接種后4到6天）,，在100%SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。
●每隔3到5天,，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×106到3×106細(xì)胞/ml,，細(xì)胞活率在90%時,，貯備的適應(yīng)了無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。
建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物,，直到每一次細(xì)胞適應(yīng)了新的混合培養(yǎng)基,。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進(jìn)行幾次傳代,。
在適應(yīng)過程中,，不要讓細(xì)胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性,。需要注意,，與有血清培養(yǎng)基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì),，因而更易于受外界因素的影響,。細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)替代血清：許多細(xì)胞利用連續(xù)適應(yīng)方法能很好的適應(yīng)，用包含F(xiàn)BS的的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1（v∶v）的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞,。通過下列的混合培養(yǎng)基的方式,，連續(xù)幾代減少當(dāng)前培養(yǎng)基的量：1∶2，1∶4,，1∶16和100%替代培養(yǎng)基,。每次適應(yīng)改變血清比例時，傳代細(xì)胞2到3次,。培養(yǎng)可以直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清,。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長的延遲可能會發(fā)生,，4允許進(jìn)行2到3次的傳代,，使生長率恢復(fù)到以前的水平。特別需要強調(diào)的是：配制無血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水,，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水,。因為無血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細(xì)胞的大分子,，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微,，也可能對細(xì)胞產(chǎn)生致死性損害。這是無血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一,。
無血清培養(yǎng)基的優(yōu)點
●增加確定性
●性能更加一致
●容易進(jìn)行純化和下游加工
●細(xì)胞功能的評估
●增強生長和/或產(chǎn)量
●生理反應(yīng)性的較好對照
●增強細(xì)胞內(nèi)中介物的檢測