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技術文章
Folin—酚法測定血清蛋白的含量
點擊次數：2170 發(fā)布時間：2013-3-25
Folin—酚法蛋白質含量測定法是zui為靈敏的方法，但其試劑也不容易配制,。本實驗的主要目的是掌握分光光度計的使用方法,，學習Folin—酚法測定血清蛋白的含量,。
一,、目的
1,、學習分光光度計的原理和使用方法。
2,、學習Folin—酚法測定蛋白質含量的原理和方法,。
3、進一步掌握比色法或分光光度法,，準確測定未知樣品,。
二、原理
蛋白質濃度從它們的物理化學性質,，如折射率,，比重，紫外吸收測定而得知,，或用化學方法,，如定氮，雙縮脲反應,，Folin—酚法是一般實驗室中經常使用的方法,。Folin—酚法是雙縮脲法的發(fā)展，反應的*步涉及到在堿性溶液中銅一蛋白質復合物的形成,，然后這個復合物去還磷鉬酸—磷鎢酸試劑（Folin氏劑）,，產生深藍色（鉬藍和鎢藍混合物）。Folin—酚法靈敏度高,，較雙縮脲法靈敏100倍,。
所測蛋白質樣品中若含酚類及檸檬酸均有干擾作用，濃度較低的尿素（約0.5%左右）,，胍（0.5%左右）,，硫酸鈉（1%），硝酸鈉（1%）,，三綠乙酸（0.5%）,，乙醇（5%）乙迷（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色反應影響,，這些物質濃度高時必須做校正曲線,。含硫酸銨的溶液只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液即可顯色測定。若樣品酸度較高,，顯色后色淺,。則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1—2倍。
三,、材料,、試劑與器具
（一）材料
血清：使用前稀釋100%
（二）試劑
1、標準酪蛋白溶液：稱取125毫克酪蛋白芬末，用0.1N氫氧化鈉溶液溶解,，加蒸餾水到250 毫升,，則配成500微克/毫升的標準酪蛋白溶液。
2,、Folin—酚試劑甲：由下述四種溶液配制而成,。
（1）4%碳酸鈉溶液
（2）0.2N氫氧化鈉溶液
（3）1%硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶液
（4）2%酒石酸鉀鈉溶液，在使用前,，將（1）和（2）等體積混合成碳酸鈉—氫氧化鈉溶液,。將（3）與（4）等體積混合配成硫酸銅—酒石酸鉀鈉溶液。然后將這兩種溶液按50：1的比例混合,，即為Folin—酚試劑甲,。該試劑只能用一天，過期失效,。
3.Folin—酚試劑乙：在2升的磨口回流裝置內加入鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）100克,，鉬酸鈉（Na2MOO4·2H2O）25克，蒸餾水700毫升,，85%磷酸50毫升和濃鹽酸100毫升,，充分沸合后以小火回流10小時，再加入硫酸鋰（Li2SO4）150克,，蒸餾水50毫升及數滴液體溴,。然后開口繼續(xù)沸騰15分鐘，以驅除過量的溴,。冷卻后定容到1000毫升,，過濾，溶液呈綠色,。
用Folin—酚試劑乙滴定標準氫氧化鈉溶液（1N左右）以標定Folin—酚試劑乙的濃度,。以酚酞為指示劑。當溶液的顏色由紅色變?yōu)樽霞t色,、紫灰,，再突然轉變?yōu)槟G時，即為終點,。該試劑酸度一般為2N左右,，此為貯存液。也可以用氫氧化鈉去滴定Folin—酚試劑乙,，但終點較不易掌握,，此時溶液顏色由淺黃變?yōu)闇\綠，再變?yōu)榛易蠟榻K點,。
使用前應予以適當稀釋,，使其成為1N的酸,，此為Folin—酚試劑乙使用液,。
以上兩液均應裝于棕色瓶內，貯于冰箱中,，可以長期保存。
（三）器具
1,、試管及試管架
2,、吸量管（1，5毫升）
3,、可見光分光光度計
四,、操作步驟
（一）標準曲線的制作
取12支試管，分別加入0, 0.2 , 0.4, 0.6, 0.8, 1.0毫升標準酪蛋白溶液（500微克/毫升）用水補足到1.0毫升,，以上每種濃度各做一份重復,，即平行做兩份,，按順序向各管加入3毫升Folin—酚試劑甲，混勻,，室溫下放置10分鐘,，再依次向各管加入0.3毫升Folin—酚試劑乙，立即搖勻,，在30℃保溫（或室溫下放置）30分鐘,，然后于500nm處比色?？磧蓚€平行管的光密度值是否接近,，取其平均值，以光密度（0.D）為縱坐標,，以酪蛋白溶液濃度為橫坐標,，繪制酪蛋白的標準曲線。
（二）血清樣品的測定
取2支試管,，各加入一定量血清稀釋液（應使其蛋白質含量在酪蛋白標準曲線范圍之內）本實驗取0.4毫升血清稀釋液,，再加0.6毫升蒸餾水使樣品體積達到1毫升。其他操作與“標準曲線的制作”相同,。
（三）計算
將血清樣品的光密度讀數在標準曲線上查出相應標準酪蛋白溶液的濃度,，再折算成每毫升血清稀釋液含蛋白質的微克數。然后乘以稀釋倍數,，得出每毫升未稀釋血清蛋白質的微克數，zui后打算成臨床化驗上通用的單位克%，即100毫升血清中含蛋白質的克數,。
五,、注意事項
1,、Folin—酚法所用的試劑是由兩部分組成，試劑甲相當于雙縮脲試劑,，可與蛋白質中的肽鍵起顯色反應,，試劑乙（磷鉬酸和磷鎢酸混合液）在堿性條件下極不穩(wěn)定,，易被銅—蛋白質復合物還原成鉬藍和鎢藍,。因此，在進行測定時加Folin—酚試劑要特別小心,，因為Folin—酚試劑乙僅在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上還原反應只是在pH10的條件下發(fā)生,，故當Folin—酚試劑乙加到堿性的銅—蛋白質溶液中時,，必須立即混勻。以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前,，（還原反應即能發(fā)生）能有效地被Cu2+—蛋白質結合物所還原,。
2、此法也適用于酪氨酸和色氨的定量測定,。
六,、實驗報告
繪制標準曲線，將實驗所獲結果與其他蛋白定量測定方法比較,，說明其優(yōu)缺點,。