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細(xì)胞培養(yǎng)中死活細(xì)胞測(cè)定及細(xì)胞活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)
點(diǎn)擊次數(shù)：3353 發(fā)布時(shí)間：2013-3-23
細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中需要測(cè)定細(xì)胞的存活率以了解細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，鑒定細(xì)胞存活常用的方法有染色法和儀器分析法。染色法可直接通過(guò)細(xì)胞形態(tài),，區(qū)別細(xì)胞死亡,，它是一種簡(jiǎn)單的細(xì)胞存活鑒定方法。這里總結(jié)下死活細(xì)胞測(cè)定及細(xì)胞活力測(cè)定實(shí)驗(yàn)原理,、實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng),。
【實(shí)驗(yàn)原理】
（一）染色法是常用的細(xì)胞死活鑒定方法，簡(jiǎn)便,，易于操作,。實(shí)驗(yàn)是利用了死活細(xì)胞在生理機(jī)能和性質(zhì)上的差異來(lái)進(jìn)行的。死活細(xì)胞在生理機(jī)能和性質(zhì)上的差異主要體現(xiàn)在：
（1）死活細(xì)胞細(xì)胞膜通透性的差異：活細(xì)胞的細(xì)胞膜是一種選擇性膜,，對(duì)細(xì)胞起保護(hù)和屏障作用,，只允許物質(zhì)選擇性的通過(guò);而細(xì)胞死亡之后，細(xì)胞膜受損,，通透性增加,。
（2）死活細(xì)胞在代謝上的差異：由于活細(xì)胞中新陳代謝的作用，使細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力,，而死細(xì)胞或代謝緩慢的老細(xì)胞,，則因它們的無(wú)還原能力或還原能力極弱。
常見(jiàn)的細(xì)胞染料有：中性紅（細(xì)胞器的專有染料）,、臺(tái)盼藍(lán),、甲基藍(lán)、美藍(lán),、熒光素雙醋酸酯（FDA）等,。
① 中性紅染色：常用染料之一，是細(xì)胞器的專有染料,。利用細(xì)胞膜的通透性差異,，用來(lái)染原生動(dòng)物和顯示動(dòng)植物組織中活細(xì)胞的內(nèi)含物等。中性紅無(wú)毒,，常做活體染色的染料,。
② 臺(tái)盼藍(lán)染色：當(dāng)細(xì)胞損傷或死亡時(shí)，臺(tái)盼藍(lán)可穿透變性的細(xì)胞膜,，與解體的DNA 結(jié)合,，使其著色。而活細(xì)胞能阻止染料進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),。故可以鑒別死細(xì)胞與活細(xì)胞,。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)的是細(xì)胞膜的完整性,，通常認(rèn)為細(xì)胞膜喪失完整性,，即可認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡,。通過(guò)顯微鏡很容易就能識(shí)別出死亡的被臺(tái)盼藍(lán)染色的細(xì)胞,，并可使用細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù),。
③ 美藍(lán)染色法：美藍(lán)是一種無(wú)毒性染料，它的氧化型是藍(lán)色的,，而還原型是無(wú)色的,，用它來(lái)對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色，由于細(xì)胞中新陳代謝的作用,，使細(xì)胞內(nèi)具有較強(qiáng)的還原能力,，能使美藍(lán)從藍(lán)色的氧化型變?yōu)闊o(wú)色的還原型，所以活細(xì)胞無(wú)色,，而對(duì)于死細(xì)胞或代謝緩慢的老細(xì)胞,，則因它們無(wú)此還原能力或還原能力極弱，而被美藍(lán)染成藍(lán)色或淡藍(lán)色,。因此,，用美藍(lán)水浸片不僅可觀察酵母的形態(tài)，還可以區(qū)分死,、活細(xì)胞.
④ 甲基藍(lán)染色法：甲基藍(lán)染色與臺(tái)盼藍(lán)類似的染色機(jī)理,。
（二）植物細(xì)胞質(zhì)壁分離法及活體染色測(cè)定細(xì)胞死活
（1）質(zhì)壁分離法：成長(zhǎng)的植物細(xì)胞一般具有中央液泡，在中央液泡和細(xì)胞壁之間為細(xì)胞質(zhì)的薄層及其內(nèi)外膜——液泡膜和質(zhì)膜,。液泡中的胞液具有一定的溶質(zhì)勢(shì)（或稱滲透勢(shì)）,，而活的原生質(zhì)特別是液泡膜和質(zhì)膜則具有半透性。所以,，當(dāng)細(xì)胞與外界溶液接觸時(shí),，便與外液構(gòu)成滲透系統(tǒng)，并可能發(fā)生水分的移動(dòng),。若外液的水勢(shì)低于胞液的溶質(zhì)勢(shì),，則水分外滲的結(jié)果可使原生質(zhì)隨著液泡一起收縮而脫離細(xì)胞壁，發(fā)生質(zhì)壁分離,，質(zhì)壁分離的細(xì)胞與水或水勢(shì)較高的溶液接觸時(shí),，可重新吸水而是質(zhì)壁分離復(fù)原。
（2）活體染色法：活體染色是利用某種對(duì)植物無(wú)害的染料稀溶液對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色技術(shù),。中性紅是常用的染料之一,，它是一種弱堿性pH6.4～8.0之間（由紅變黃），在中性或微堿性環(huán)境中,，植物的活細(xì)胞能大量吸收中性紅并向液泡中排泌,，由于液泡在一般情況下呈酸性反應(yīng)，因此,，進(jìn)入液泡的中性紅便解離出大量陽(yáng)離子而呈現(xiàn)桃紅色,。在這種情況下,，原生質(zhì)和細(xì)胞壁一般不著色。死細(xì)胞由于原生質(zhì)變性凝固,，胞液不能維持在液泡內(nèi),，因此，用中性紅染色后,，不產(chǎn)生液泡著色現(xiàn)象,，相反，中性紅的陽(yáng)離子卻與帶有一定負(fù)電荷的原生質(zhì)及細(xì)胞核結(jié)合,，而使原生質(zhì)與細(xì)胞核染色,。
【實(shí)驗(yàn)步驟】
1、 試劑的配置：
① 臺(tái)盼藍(lán)：4%臺(tái)盼藍(lán)母液：稱取4g臺(tái)盼藍(lán),，加少量蒸餾水研磨,，加雙蒸水至100ml，用濾紙過(guò)濾,，4度保存,。使用時(shí)。用PBS稀釋至0.4%,。
② 中性紅：先配成1%中性紅水溶液（1克中性紅溶于100毫升蒸餾水中）,。取這種溶液1毫升，用0.6%生理鹽水（或蒸餾水）稀釋到50毫升,，即成0.02%中性紅水溶液,，貯存在棕色瓶里，放在黑暗處,。
③ 美藍(lán)：取0.5克美藍(lán),，溶于30毫升95%酒精中，加100毫升0.01%氫氧化鉀溶液,，保存在棕色瓶?jī)?nèi),。此溶液能染細(xì)胞核，還用來(lái)染細(xì)菌,、血和神經(jīng)組織等,。
④ 甲基藍(lán)：取1克甲基藍(lán)，溶于29毫升70%酒精中,，加入70毫升蒸餾水,，即成1%甲基藍(lán)染液。
2,、 染色操作步驟：略
3,、 細(xì)胞活力測(cè)定：染色過(guò)的細(xì)胞材料，放在顯微鏡下觀察,。凡未染或染色及淺的細(xì)胞是有活力的,，而染色深的細(xì)胞是無(wú)活力的死細(xì)胞,。
4、 按公式計(jì)算出細(xì)胞活力,。 細(xì)胞活力（%）=未染色的細(xì)胞數(shù)/觀察的細(xì)胞總數(shù) X 100%
【注意事項(xiàng)】
1. 臺(tái)盼藍(lán)對(duì)人體有毒
2. 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí),，時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。否則,，部分活細(xì)胞也會(huì)著色,，會(huì)干擾計(jì)數(shù),。