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技術(shù)文章
單細(xì)胞凝膠電泳的操作流程與注意事項(xiàng)
點(diǎn)擊次數(shù)：2341 發(fā)布時(shí)間：2013-1-11
單細(xì)胞凝膠電泳（又名彗星實(shí)驗(yàn)）的操作流程主要包括單細(xì)胞懸液的制備,、凝膠板制備、細(xì)胞裂解與解旋,、電泳與中和,、染色和觀察等步驟。本文總結(jié)了單細(xì)胞凝膠電泳操作步驟和注意事項(xiàng),，希望對(duì)初入實(shí)驗(yàn)的同學(xué)有幫助。
1,、分離制備單細(xì)胞懸液：
?。?）體外培養(yǎng)的細(xì)胞株：用胰酶消化，zui后用PBS懸浮吹打成單細(xì)胞懸液,，細(xì)胞要計(jì)數(shù),，具體的量我前邊已經(jīng)說(shuō)過(guò)。
?。?）體內(nèi)臟器細(xì)胞：處死動(dòng)物,，取出臟器，于Hanks’液中制備成單個(gè)細(xì)胞懸液。
2,、膠板制備：
?。?）取100μl于45℃水浴中保溫的0.5%NMA，鋪于磨沙載玻片上,，形成底膠,。蓋玻片推勻，不能有氣泡,，4度凝固5至8分鐘,。
（2）水平取下蓋片,，取100μl于37℃水浴中保溫的0.5%LMA與20μl細(xì)胞懸液（約400個(gè)細(xì)胞）混勻，立即鋪片,，加上蓋玻片,，4度凝固5至8分鐘。
3,、細(xì)胞裂解與電泳：
?。?）將制備好的膠板去掉蓋玻片后，浸于4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中,，在4℃下裂解2.5到3小時(shí),。
（2）取出膠板,，用雙蒸水浸沒(méi)漂洗后放入電泳槽中,，浸泡在4℃預(yù)冷的電泳液中解旋20分鐘。
?。?）玻片水平放置陽(yáng)附近,，4℃電泳20到25分鐘（25V，300mA）,?？稍陔娪静壑車颖鶋K以保持低溫。
4,、中和與染色：
?。?）電泳結(jié)束，將膠板浸泡于中和液中,，每次10分鐘,，共中和3次，每次要更換中和液,。zui后晾干,。
?。?）取出膠板，置于染色缸中,，在2μg/ml的EB染色液中,，暗處染色5到10分鐘。
?。?）蒸餾水漂洗2次，每次5分鐘,。
稍晾干,，濾紙吸去多余水分，盡快在熒光顯微鏡下觀察,。
注意事項(xiàng)：
1.細(xì)胞一定要消化成單個(gè)的,，如果你養(yǎng)的細(xì)胞是懸浮生長(zhǎng)的，或者形狀是圓形的（例如hela）,，那么你可以直接用細(xì)胞刮收細(xì)胞做,，否則，如果細(xì)胞是非圓形的,，例如成纖維細(xì)胞等,，一定要用胰酶消化，使之成圓形,，然后才可做實(shí)驗(yàn),。很多做彗星實(shí)驗(yàn)總是出不來(lái)結(jié)果的，可以考慮下是否是這方面的原因,。
2.電泳時(shí),，電流與電壓強(qiáng)度在每次實(shí)驗(yàn)時(shí)要恒定（例如：20V，200mA恒定）,，這樣出來(lái)的慧尾才有分析價(jià)值,，否則你不知道分析因素的差異是由電泳條件的改變引起的還是細(xì)胞處理不同引起的。
3.關(guān)于掉膠的問(wèn)題：蓋玻片兩面都涂上剝離硅烷（挺便宜的一大瓶,，但是有毒）,，這樣會(huì)好很多
4.裂解液是整個(gè)實(shí)驗(yàn)中zui關(guān)鍵的因素，裂解液zui終使用時(shí)必須是澄清沒(méi)有任何沉渣的,，如果沒(méi)有溶解好是肯定影響實(shí)驗(yàn)的,，如果常溫不容易溶解的話可以放入4℃冰箱中一段時(shí)間，就比較容易溶解了
小結(jié)：本實(shí)驗(yàn)所有操作步驟從膠板制備開(kāi)始到zui后都應(yīng)該在暗光或者紅光下操作,，實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟是凝膠制備,，一定要均勻平整無(wú)氣泡,，此外要避免試驗(yàn)中細(xì)胞裂解液等有毒物質(zhì)對(duì)自己的傷害
1,、分離制備單細(xì)胞懸液：
?。?）體外培養(yǎng)的細(xì)胞株：用胰酶消化，zui后用PBS懸浮吹打成單細(xì)胞懸液,，細(xì)胞要計(jì)數(shù),，具體的量我前邊已經(jīng)說(shuō)過(guò)。
?。?）體內(nèi)臟器細(xì)胞：處死動(dòng)物,，取出臟器，于Hanks’液中制備成單個(gè)細(xì)胞懸液。
2,、膠板制備：
?。?）取100μl于45℃水浴中保溫的0.5%NMA，鋪于磨沙載玻片上,，形成底膠,。蓋玻片推勻，不能有氣泡,，4度凝固5至8分鐘,。
（2）水平取下蓋片,，取100μl于37℃水浴中保溫的0.5%LMA與20μl細(xì)胞懸液（約400個(gè)細(xì)胞）混勻，立即鋪片,，加上蓋玻片,，4度凝固5至8分鐘。
3,、細(xì)胞裂解與電泳：
?。?）將制備好的膠板去掉蓋玻片后，浸于4℃預(yù)冷的細(xì)胞裂解液中,，在4℃下裂解2.5到3小時(shí),。
（2）取出膠板,，用雙蒸水浸沒(méi)漂洗后放入電泳槽中,，浸泡在4℃預(yù)冷的電泳液中解旋20分鐘。
?。?）玻片水平放置陽(yáng)附近,，4℃電泳20到25分鐘（25V，300mA）,?？稍陔娪静壑車颖鶋K以保持低溫。
4,、中和與染色：
?。?）電泳結(jié)束，將膠板浸泡于中和液中,，每次10分鐘,，共中和3次，每次要更換中和液,。zui后晾干,。
?。?）取出膠板，置于染色缸中,，在2μg/ml的EB染色液中,，暗處染色5到10分鐘。
?。?）蒸餾水漂洗2次，每次5分鐘,。
稍晾干,，濾紙吸去多余水分，盡快在熒光顯微鏡下觀察,。
注意事項(xiàng)：
1.細(xì)胞一定要消化成單個(gè)的,，如果你養(yǎng)的細(xì)胞是懸浮生長(zhǎng)的，或者形狀是圓形的（例如hela）,，那么你可以直接用細(xì)胞刮收細(xì)胞做,，否則，如果細(xì)胞是非圓形的,，例如成纖維細(xì)胞等,，一定要用胰酶消化，使之成圓形,，然后才可做實(shí)驗(yàn),。很多做彗星實(shí)驗(yàn)總是出不來(lái)結(jié)果的，可以考慮下是否是這方面的原因,。
2.電泳時(shí),，電流與電壓強(qiáng)度在每次實(shí)驗(yàn)時(shí)要恒定（例如：20V，200mA恒定）,，這樣出來(lái)的慧尾才有分析價(jià)值,，否則你不知道分析因素的差異是由電泳條件的改變引起的還是細(xì)胞處理不同引起的。
3.關(guān)于掉膠的問(wèn)題：蓋玻片兩面都涂上剝離硅烷（挺便宜的一大瓶,，但是有毒）,，這樣會(huì)好很多
4.裂解液是整個(gè)實(shí)驗(yàn)中zui關(guān)鍵的因素，裂解液zui終使用時(shí)必須是澄清沒(méi)有任何沉渣的,，如果沒(méi)有溶解好是肯定影響實(shí)驗(yàn)的,，如果常溫不容易溶解的話可以放入4℃冰箱中一段時(shí)間，就比較容易溶解了
小結(jié)：本實(shí)驗(yàn)所有操作步驟從膠板制備開(kāi)始到zui后都應(yīng)該在暗光或者紅光下操作,，實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟是凝膠制備,，一定要均勻平整無(wú)氣泡,，此外要避免試驗(yàn)中細(xì)胞裂解液等有毒物質(zhì)對(duì)自己的傷害