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公司技術(shù)介紹Real-time PCR定量的四種方法
點擊次數(shù)：1458 發(fā)布時間：2012-12-24
實時熒光PCR定量包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加,，非探針類則是不利用雜交原理,，而利用其他的一些理化特征指示擴增產(chǎn)物的增加。前者由于增加了探針的識別步驟,，特異性更高,，但后者則簡便易行。
1.TaqMan 探針
TaqMan 探針是一種寡核苷酸探針,，熒光基團連接在探針的5’末端,， 而淬滅劑則在3’末端。當探針與靶序列配對時,，熒光基團發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅,。在進行延伸反應時，聚合酶的5’外切酶活性將探針切斷,， 使得熒光基團與淬滅劑分離,，發(fā)射熒光。一分子的產(chǎn)物生成就伴隨著一分子的熒光信號的產(chǎn)生,。隨著擴增循環(huán)數(shù)的增加,，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此Taqman探針檢測的是積累熒光,。常用的熒光基團是FAM,，TET，VIC,，HEX,。
2.分子信標（molecular beacon）
分子信標是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對,，因此標記在一端的熒光基團與標記在另一端的淬滅基團緊緊靠近,。熒光基團被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，由熒光基團產(chǎn)生的能量以紅外而不是可見光形式釋放出來,。
分子信標的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中,，環(huán)一般為15-30 個核苷酸長，并與目標序列互補;莖一般5-7 個核苷酸長,，并相互配對形成莖的結(jié)構(gòu),。熒光基團標記在探針的一端，而淬滅劑則標記在另一端,。在復性溫度下,，因為模板不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu),，當加熱變性會互補配對的莖環(huán)雙鏈解開,，如果有模板存在環(huán)序列將與模板配對,。與模板配對后，分子信標將成鏈狀而非發(fā)夾狀,，使得熒光基團與淬滅劑分開,。當熒光基團被激發(fā)時，因淬滅作用被解除,，發(fā)出激發(fā)光子,。由于是酶切作用的存在，分子信標也是積累熒光,。常用的熒光基團：FAM ,，Texas Red 。
3.SYBR Green I
SYBR Green I 是一種能與雙鏈DNA 結(jié)合發(fā)光的熒光染料,。其與雙鏈DNA結(jié)合后,， 熒光大大增強。因此,， SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān),，可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。SYBR Green I 的zui大吸收波長約為497nm,，發(fā)射波長zui大約為520nm,。
SYBR Green I 的缺點：由于SYBR Green I沒有特異性，不能識別特定的雙鏈,，只要是雙鏈就會結(jié)合發(fā)光,，對PCR反應中的非特異性擴增或引物二聚體也會產(chǎn)生熒光。所以在臨床上使用可能會有假陽性發(fā)生,。
SYBR Green I的優(yōu)點：SYBR Green I的優(yōu)點是因為其缺點產(chǎn)生,，由于它能所有的雙鏈DNA相結(jié)合，所以對不同模板不需特別定制,，通用性好,，并且價格相對較低。這對科研是很有利的,，因此國內(nèi)外在科研中使用比較普遍,。
4. 熒光諧振能量傳遞（FRET）
FRET探針是羅氏的發(fā)明，又稱雙雜交探針,，F(xiàn)RET探針由兩條相鄰探針組成,，在一條探針的5`端標記FAM熒光基團，另一探針的3`端標記Red 640熒光基團,。當復性時,，探針結(jié)合在模板上，F(xiàn)AM基團和Red640基團相鄰，激發(fā)FAM產(chǎn)生的熒光,，作為Red640基團的激發(fā)光被吸收,，使Red640發(fā)出波長為640的熒光。當變性時,，探針游離,，兩基團距離遠，不能產(chǎn)生640波長的熒光,。由于FRET探針是靠近發(fā)光,，所以檢測信號是實時信號，非累積信號,。常用的熒光基團是：LC-Red640,，LC-Red705。
5.LUX Primers
LUX （light upon extention） 引物是利用熒光標記的引物實現(xiàn)定量的一項新技術(shù),。目的使用類分子信標的發(fā)夾結(jié)構(gòu)設計引物,，使引物同時起到熒光探針的作。引物對中的一個引物3’端用熒光報告基團標記,。在沒有單鏈模板的情況下,，該引物自身配對，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),，使熒光淬滅,。在模板存在的情況下，引物與模板配對,，發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開,，產(chǎn)生熒光信號。使用LUX引物,，不需要專門設計探針,，即省了成本又給實驗設計提供了寬松的條件。由于沒有探針控制特異性,，因此他的特異性要弱于探針技術(shù),，但非特異性擴增或引物二聚體沒有影響，所以其特異性要強于SYBR GREEN,。
圖.LUX 引物工作原理
能用于實時熒光PCR定量的方法很多,，各有特點。
| SYBR GREEN | FRET探針 | Taqman | 分子信標 | LUX 引物 | |
| 性質(zhì) | 可逆熒光 | 積累熒光 | |||
| 熔點分析 | 能 | 不能 | |||
| 特異性 | 引物（非特異性擴增或引物二聚體有影響） | 引物＋2探針 | 引物＋探針 | 引物＋探針 | 引物（非特異性擴增或引物二聚體無影響） |
| 探針 | 不需要 | 需要 | 需要 | 需要 | 不需要 |
| 通用性 | 通用 | ||||
這里僅列舉了熒光定量PCR定量的四種方法的原理,，各自的特點,。希望對大家有用。