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    大鼠纖溶酶原激活物抑制因子 1（PAI-1）試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用    

目的：本試劑盒用于測定大鼠血清，血漿及相
關(guān)液體樣本中纖溶酶原激活物抑制因子1（PAI-1）的含量,。
實(shí)驗(yàn)原理：
   本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標(biāo)本中大鼠纖溶酶原激活物抑制因子1（PAI-1）水平,。用
純化的大鼠纖溶酶原激活物抑制因子 1（PAI-1）抗體包被微孔板，制成固相抗體,，往包被單
抗的微孔中依次加入PAI-1,，再與HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)
合物,，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色,。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的
作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的 PAI-1 呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在 450nm 波
長下測定吸光度（OD值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中大鼠纖溶酶原激活物抑制因子1（PAI-1）
濃度,。

試劑盒組成：
試劑盒組成 48 孔配置 96 孔配置 保存
說明書 1 份 1 份
封板膜 2 片（48） 2 片（96）
密封袋 1 個 1 個
酶標(biāo)包被板 1×48 1×96 2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品：900ng/L 0.5ml×1 瓶 0.5ml×1 瓶 2-8℃保存
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 1.5ml×1 瓶 1.5ml×1 瓶 2-8℃保存
酶標(biāo)試劑 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
樣品稀釋液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
顯色劑A 液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
顯色劑B液 3 ml×1 瓶 6 ml×1 瓶 2-8℃保存
終止液 3ml×1 瓶 6ml×1 瓶 2-8℃保存
濃縮洗滌液 （20ml×20 倍）×1 瓶 （20ml×30 倍）×1 瓶 2-8℃保存

樣本處理及要求：
1.  血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上
清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心,。
2.  血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后,，離心
20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次
離心,。
3.  尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過程
中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實(shí)行。
4.  細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時,，用無菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/
分）。仔細(xì)收集上清,。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時,，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右,。通過反復(fù)凍融,，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分
鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。
5.  組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后,，稱取重量。加入一定量的PBS,，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)?br />用。標(biāo)本融化后仍然保持 2-8℃的溫度,。加入一定量的 PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器
將標(biāo)本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。分裝后一份待
檢測,，其余冷凍備用。
6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上
進(jìn)行試驗(yàn),，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.
7.  不能檢測含NaN3的樣品，因 NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。

操作步驟：
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔 10 孔,，在*、第二孔中分別加標(biāo)
準(zhǔn)品 100μl,，然后在*,、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl，混勻,；然后從*孔,、第二
孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三,、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50μl,，
混勻,；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,，再各取50μl分別加到第五、第六孔
中,，再在第五,、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻,；混勻后從第五,、第六孔中各
取 50μl 分別加到第七、第八孔中,，再在第七,、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液 50μl，混
勻后從第七,、第八孔中分別取 50μl 加到第九,、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn)
品稀釋液50μl,，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉,。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，
濃度分別為600 ng/L，400ng/L ,，200ng/L,，100ng/L，50 ng/L）,。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑,，其余各步操作相同）、待測樣
品孔,。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl（樣
品zui終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混
勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 分鐘,。
4. 配液：將 30（48T的 20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的 20倍）倍稀釋后備用,。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體,，甩干,，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去,，如此
重復(fù) 5次,，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,，空白孔除外,。
7. 溫育：操作同 3。
8. 洗滌：操作同 5,。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl,，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色
15分鐘.
10. 終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11. 測定：以空白空調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,。 測定應(yīng)在加終止
液后 15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
注意事項(xiàng)：
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標(biāo)包被板開封后如未
用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,，稀釋時可在水浴中加溫助溶,，洗滌時不影響結(jié)果。
3．各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準(zhǔn)確性,，以避免試驗(yàn)誤差,。一次加樣時間
控制在5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣,。
4．請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，做復(fù)孔,。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔*孔的OD值）,，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n 倍）后再測定，計
算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。
5．封板膜只限一次性使用,，以避免交叉污染。
6．底物請避光保存,。
7．嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行,，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。
9．本試劑不同批號組分不得混用,。
10.  如與英文說明書有異，以英文說明書為準(zhǔn),。
計算：
以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo),，OD值為縱坐標(biāo)，    
在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD     
值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,；再乘以稀釋     
倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計算出標(biāo)     
準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值     
代入方程式,，計算出樣品濃度,，再乘以稀釋     
倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度。                 
 
                                                
（此圖僅供參考）

試劑盒性能：
1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上,。
2.批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于9%和 11%
檢測范圍：                                                 
30ng/L -800 ng/L                                         
                           
保存條件及有效期：
1.試劑盒保存：,；2-8℃。
2．有效期：6個月