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豬流感H3N2酶聯(lián)免疫分析（ELISA） 試劑盒使用說明書
點(diǎn)擊次數(shù)：1320 發(fā)布時(shí)間：2012-9-27
豬流感H3N2酶聯(lián)免疫分析（ELISA） 試劑盒使用說明書 本試劑僅供研究使用 目的：本試劑盒用于測定豬血清，血漿及相關(guān)液體樣本中流感H3N2的表達(dá),。 實(shí)驗(yàn)原理： 本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法（ELISA）測定標(biāo)本中豬流感H3N2,。用純化的豬流感H3N2抗體包被微孔板，制成固相抗體,，可與樣品中豬流感H3N2抗原相結(jié)合,，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后再與HRP標(biāo)記的豬流感H3N2抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色,。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，與CUTOFF值相比較，從而判定標(biāo)本中豬流感H3N2的存在與否,。 試劑盒組成： 試劑盒組成 48孔配置 96孔配置 保存 說明書 1份 1份 封板膜 2片（48） 2片（96） 密封袋 1個(gè) 1個(gè) 酶標(biāo)包被板 1×48 1×96 2 陰性對(duì)照 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2 陽性對(duì)照 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2 酶標(biāo)試劑 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2 樣品稀釋液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2 顯色劑A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2 顯色劑B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2 終止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2 濃縮洗滌液 （20ml×20倍）×1瓶 （20ml×30倍）×1瓶 2 樣本處理及要求： 1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心。 2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次離心,。 3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。胸腹水,、腦脊液參照實(shí)行。 4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時(shí),，用無菌管收集,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,。檢測細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí),，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右,。通過反復(fù)凍融,，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心,。 5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后,，稱取重量。加入一定量的PBS,，PH7.4,。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩?biāo)本融化后仍然保持2 6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),，可將標(biāo)本放于 7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。 操作步驟： 1. 編號(hào)：將樣品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),，每板應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照2孔、陽性對(duì)照2孔,、空白對(duì)照1孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同） 2. 加樣：分別在陰,、陽性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照,、陽性對(duì)照50μl。然后在待測樣品孔先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl,。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻,， 3. 溫育：用封板膜封板后置 4. 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液加蒸餾水至600ml后備用 5. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次，拍干,。 6. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑50μl,，空白孔除外。 7. 溫育：操作同3,。 8. 洗滌：操作同5,。 9. 顯色：每孔先加入顯色劑A 50μl，再加入顯色劑B 50μl,，輕輕震蕩混勻,， 10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。 11. 測定：以空白空調(diào)零,，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行,。 結(jié)果判定： 試驗(yàn)有效性：陽性對(duì)照孔平均值≥1.00; 陰性對(duì)照平均值≤0.15 臨界值（CUT OFF）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.20 陰性判定：樣品OD值< 臨界值（CUT OFF）者為豬流感H3N2陰性 陽性判定：樣品OD值≥ 臨界值（CUT OFF）者為豬流感H3N2陽性 注意事項(xiàng) 1．操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行,，本試劑不同批號(hào)組分不得混用,。 2．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存,。 3．濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,，洗滌時(shí)不影響結(jié)果,。 4． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染,。 5．底物請(qǐng)避光保存,。 6．試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn)，使用雙波長檢測時(shí),，參考波長為630nm 7．所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。終止液為 保存條件及有效期 1．試劑盒保存：；2 2．有效期：6個(gè)月