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單個細胞的PCR分析
點擊次數(shù)：1168 發(fā)布時間：2017-8-16
單個二倍體細胞
在分析單精子以前，Li等人對個體二倍體細胞內的β珠蛋白基因進行過研究,。兩 個組織培養(yǎng)細胞株用于這些實驗,。其中一個純合是鐮刀型細胞密碼子6（βS）發(fā)生突 變，另一個純合子則來源于正常的βB等位基因,。擴增含有密碼子6的β珠蛋白片段的 引物,，及能夠區(qū)別這兩個特異的等位基因的寡核苷酸探針（ASO）已經(jīng)報道過。βA純 事細胞和βB純合細胞和βS純合細胞在同一組織培養(yǎng)瓶中共同培養(yǎng)數(shù)天,。將用相差顯 微鏡觀察到的混合培養(yǎng)的單個細胞轉入溥塑料胡管內,。分別將單個細胞轉入含裂解液 的PCR管中，保溫后,，加入PCR緩沖液,，緩中有四種dDNP．Taq dna聚合酶和擴增已知 珠蛋白基因的PCR引物。95℃10分鐘變性靶DNA,，然后根據(jù)已發(fā)表方法的改進方案進行 50全循環(huán)的擴增,。通過打點雜交，等量的擴增產(chǎn)物打點于尼龍膜后,，擴增產(chǎn)物分別與 βA和βS的探針雜交,。所分析的37個細胞中，84％細胞只與βA和βS探針雜交,，雜交 強弱各不相同,；19個與βA探針．12個與βS探針雜交,。12個以水作空白對照的反應管 中瓜呈陰性，它表明忽略不記DNA的污染,。沒有與兩種探針都雜交的樣品,，它暗示轉 入到反應管中的單個細胞，而且組織培養(yǎng)基中存在的從βA或βS細胞中裂解出來的 DNA并未吸附在單個細胞上,。
單個細胞的pcr擴增產(chǎn)生的β珠蛋白基因的數(shù)量通過與已知攜帶蛋白基因的質粒 DNA樣品在雜交模上的雜交信號的強度進行比較確定,。據(jù)估計PCR反應開始時，一個二 倍體細胞珠蛋白DNA量（3.0X10-24摩爾）在5－500毫微微摩爾之間,，每個PCR循環(huán)以 平均效率65％計算,，經(jīng)50個循環(huán)后它的DNA相當于平均擴增了7.6×1010倍?？紤]到擴 增的程度之大,，因此排除任何可能的污染對于單個細胞的分析十分關鍵。
單精子的分析
Li等人隨后對位于染色體19編碼LDL受體(LDLr)的基因的雜合體單精子的基因型 進行分析,。根據(jù)已知的DNA序列,，他們用PCR和ASO分析檢測LDLr的RFLP。PCR的引物和 探針以前已有報道,。單個精子的分離與二倍體細胞的分離方法一樣,，精液經(jīng)蔗糖梯度 離心得到純化的精子，精子于－20℃可保藏8個月,。顯微鏡下將單個精子吸入毛細塑 料針管內,，然后轉入試管內以作裂解。裂解的方法與發(fā)表的方法沖液(50mM KCL,， 10mM Tris.HCL,，pH8.3，2.5mM MgCl2,，0.1mg/ml明膠）,，0.05mg/ml蛋白酶K，20mM DTT和1.7μM SDS,。37℃保溫1小時,，加入pcr反應物以前，樣品加熱到85℃,。PCR擴 增,。對80個精子LDLr基因型已作過分析。55%的雄配子顯示出雜交信號,。22個攜帶 LDLr等位基因,，21個攜帶LDLr2基因。僅一個與兩種探針雜交都呈陽性,。16支對照反 應管中加入所有反應試劑但沒有精子，結果無雜交信號出現(xiàn)。兩個擴增的等位基因的 分布遵循Mendel獨立分離定理,，它表明PCR反應以單個減數(shù)分裂產(chǎn)物為起始,，無污染 的二倍體DNA存在。