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傳統(tǒng)mRNA差異顯示技術(shù)與第二代差異顯示系統(tǒng)
點擊次數(shù)：1235 發(fā)布時間：2017-8-7
真核生物中,，從個體的生長,、發(fā)育、衰老,、死亡，到組織的分化,、凋亡以及細胞對各種生物,、理化因子的應(yīng)答，本質(zhì)上都涉及基因的選擇性表達。高等生物大約有30 000個不同的基因,，但在生物體內(nèi)任意細胞中只有10%的基因得以表達,，而這些基因的表達是按事件和空間順序有序地進行著，這種表達的方式即為基因的差異表達,。其包括新出現(xiàn)的基因表達與表達量有差異的基因表達,。生物體表現(xiàn)出的各種特性，主要是由于基因的差異表達引起的,。由于基因差異表達的變化是調(diào)控細胞生命活動過程的核心機制,，通過比較同一類細胞在不同生理條件下或在不同生長發(fā)育階段的基因表達差異，可為分析生命活動過程提供重要信息,。
研究基因差異表達的主要技術(shù)有差別雜交（篩選）（differential hybridization）,、扣除（消減）雜交（subtractive hybridization of cDNA， SHD）,、mRNA差異顯示（mRNA differential display,， DD）、抑制消減雜交法（suppression subtractive hybridization,， SSH）,、代表性差異分析（represential display analysis， RDA）,、交互扣除ＲＮＡ差別顯示技術(shù)（reciprocal subtraction differential RNA display）以及基因表達系列（serial analysis of gene expression,， SAGE）分析和電子消減（electronic subtraction）和DNA微列陣分析（DNA microarray）等。
這里我們重點介紹傳統(tǒng)mRNA差異顯示技術(shù)（DDRT-PCR）和第二代差異顯示系統(tǒng)：限制性酶切片段差異顯示（RFDD-PCR）
傳統(tǒng)mRNA差異顯示技術(shù)（DDRT-PCR）是根據(jù)絕大多數(shù)真核細胞mRNA3"端具有的多聚腺苷酸尾（polyA）結(jié)構(gòu),，因此可用含oligo（dT）的寡聚核苷酸為引物將不同的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,。該方法的創(chuàng)始人Liang P和Pardee A根據(jù)Poly A序列起點前2個堿基除AA外只有12種可能性的特征，設(shè)計合成了12種下游引物,，稱3′-錨定引物,，其通式為5"-T11MN；同時為擴增出polyA上游500bp以內(nèi)所有可能性的mRNA序列,，在5′端又設(shè)計了20種10bp長的隨機引物,。這樣構(gòu)成的引物對進行pcr擴增能產(chǎn)生出20000條左右的DNA條帶，其中每一條都代表一種特定mRNA種,，這一數(shù)字大體涵蓋了在一定發(fā)育階段某種細胞類型中所表達的全部mRNA,。將差別表達條帶中的DNA回收，擴增至所需含量,，進行Southernblot或Northernblot或直接測序,，從而對差異條帶鑒定分析，以便zui終獲得差異表達的目的基因,。
原理見下圖：
傳統(tǒng)mRNA差異顯示技術(shù)與第二代差異顯示系統(tǒng) 雖然mRNA差別顯示技術(shù)（DDRT-PCR）具有很多優(yōu)點:1)速度快,較易操作;2)由于pcr擴增技術(shù)的應(yīng)用,使得低豐度mRNA的鑒定成為可能,且靈敏度高;3)可同時比較兩種以上不同來源的mRNA樣品間基因表達的差異,。但在實際操作中仍存在一些問題,主要表現(xiàn)在:
1)出現(xiàn)差別條帶太多,假陽性率高達70%左右,重復(fù)性差,且對高拷貝數(shù)的mRNA具很強的傾向性;
2）在有差異的顯示片段中難以知道哪個基因是已經(jīng)研究過的,，哪些是未知基因
3)得到的有差異的擴增條帶短,一般在110～450bp之間；
4）以poly(A)為引物的PCR擴增只適合真核生物,。
所以差別顯示技術(shù)自1992年建立后,，一直在不斷進行著改進。第二代差異顯示系統(tǒng):限制性酶切片段差異顯示（RFDD-PCR）就是一個很有效的改進,。
R傳統(tǒng)mRNA差異顯示技術(shù)與第二代差異顯示系統(tǒng)FDD-PCR不是直接擴增cDNA,而是首先限制性酶切cDNA,，再在酶切后的cDNA片段兩邊加上特殊接頭進行擴增。正是RFDD-PCR系統(tǒng)使用了一系列特殊接頭和引物,，特異性PCR引物的使用和下游的PCR反應(yīng)使RFDD-PCR分析具有高度的重復(fù)性,，解決了*代差別顯示系統(tǒng)的重復(fù)性問題；因為RFDD-PCR技術(shù)不使用以poly(A)為引物的PCR擴增,，因而該系統(tǒng)對原核和真核系統(tǒng)皆適用,；在*代的差異顯示系統(tǒng)中，下游引物特異性結(jié)合poly(A)尾,，因此與3"端未翻譯區(qū)域相對應(yīng)的差異表達序列大部分被鑒別出,，而RFDD-PCR 采用優(yōu)先切割翻譯序列的限制性內(nèi)切酶（如TaqI），因此可以優(yōu)先展示編碼區(qū),，更加適合于下游功能分析,；使用RFDD-PCR或得差異顯示基因后，與disploy Fit網(wǎng)絡(luò)相連后,，可以確定哪個基因是已經(jīng)研究過的,，哪些是未知基因，對下一步研究有很好的知道意義,?？傊琑FDD-PCR中高度嚴謹?shù)腜CR可以產(chǎn)生結(jié)果一致的基因表達圖譜,，重點放大和展示編碼區(qū),，對原核及真核RNA都有用，大大消除假陽性,。原理見右圖