QQ交談
您所在位置：請輸入產品關鍵字：
郵編：200431
聯(lián)系人：王小姐
電話：021-56640936
傳真：021-33250231
手機：13122441390 15900755943
留言：發(fā)送留言
個性化：www.shifengsj.com
網址：www.shfeng-edu.com
商鋪：http://sorrent.com.cn/st236594/
原位聚合酶鏈式反應與原位反轉錄聚合酶鏈式反應操作規(guī)程
點擊次數：1474 發(fā)布時間：2017-8-2
原位聚合酶鏈式反應（in situ PCR）和原位反轉錄聚合酶鏈式反應（in situ RT-PCR）操作規(guī)程
（一）,、儀器設備
英國Thermo Hybaid原位PCR儀。
（二）,、操作流程
1,、原位PCR步驟
1）預處理：
（1）切片常規(guī)脫蠟；
（2）0.2mol/L HCl處理10min,；
（3）5μg/ml蛋白酶k消化組織37℃10min,；
（4）Nase消化組織37℃ 30min；
（5）梯度酒精脫水,，室溫干燥,。
2）原位擴增：
（1）切片滴加特異性序列引物30μLpcr擴增反應液，覆蓋硅化蓋玻片,，石蠟油封邊,；
（2）PCR熱循環(huán)：94℃，1min,；55℃,，1min；72℃,，1.5min,，共25～30個循環(huán)，72℃延伸10min,；
（3）氯洗去蓋玻片,，4％多聚甲醛后固定10min，梯度酒精脫水,，干燥,。
3) 原位雜交：
（1）加地高辛標記探針的雜交液，98℃變性10min,，-20℃退火5min,，42℃雜交過夜。
（2）雜交后用2×SSC洗滌10min,，3次,，1×SSC洗滌10min，3次,；
（3）緩沖液洗滌10min,，3次；
（4）加堿性磷酸酶標記的羊抗地高辛抗體復合物,，37℃,，2h,；
（5）緩沖液洗滌5min，3次,；
（6）NBT,、BCIP暗處顯色，鏡下控制,，終止顯色,。
（7）常規(guī)脫水：透明、封固,。
2,、原位RT-PCR步驟
1）預處理：
（1）蛋白酶K(0.3mg/mL) 54℃消化20min，蒸餾水洗,；
（2）95℃加熱3min,，滅活殘存的蛋白酶。
2）原位擴增：
（1）在有RNA酶抑制劑存在的條件下,，用隨機六聚物進行逆轉錄反應,；
（2）用熱啟動法進行PCR擴增。標本加熱至75℃時加上反應液,，覆以蓋玻片,，四周用指甲油密封。然后將溫度升至95℃,，2min,。再將熱循環(huán)儀設定為95℃，45s,，55℃，1min和75℃,，45s,，共26次循環(huán)；
（3）擴增結束后,，在80℃烤15min～30min,。
3）原位雜交：
（1）雜交前標本95℃加熱3min；
（2）加上雜交液,，濕盒內50℃過夜,；雜交液組成：25％硫酸葡聚糖，2×SSC,，50％甲酰胺,，0.33mg/ml變性的鮭魚精子DNA， 每0．5mL雜交液內含生物素標記探針1ng,。
（3）擴增的β-肌動蛋白和IL-6用DAKO檢測試劑盒K600(鏈霉卵白素,，生物素標記的堿性磷酸酶和硝基四氮唑藍)檢測,。陽性反應呈紫色。