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質(zhì)粒提取
點擊次數(shù)：1157 發(fā)布時間：2017-6-22
一,、導論
已經(jīng)提出過許多方法用于從細菌中提純質(zhì)粒dna,， 這些方法都含有以下3個步驟：
（一）細菌培養(yǎng)物的生長
從瓊脂平板上挑取一個單菌落，接種到培養(yǎng)物中(有含有行當抗生素的液體培養(yǎng)基中生長),，然后從中純化質(zhì)粒,，質(zhì)粒的提純幾乎總是如此。現(xiàn)在使用的許多質(zhì)粒載體（如pUC系列）都能復制到很高的拷貝數(shù),，惟致只要將培養(yǎng)物放在標準LB 培養(yǎng)基中生長到對數(shù)晚期,，就可以大量提純質(zhì)粒。此時,，不必造反性地擴增質(zhì)粒DNA,。然而，較長一代的載體(如pBR322)由于不能如此自由地復制,，所以需要在得到部分生長的細菌培養(yǎng)物中加入氯霉素繼續(xù)培養(yǎng)若干小時,，以便對質(zhì)粒進行性擴增。氯霉素可抑制宿主的蛋白質(zhì)合成,，結果阻止了細菌染色體的復制，然而,，松弛型質(zhì)粒仍可繼續(xù)復制,，在若干小時內(nèi)，其拷貝數(shù)持續(xù)遞增,。這樣,，像pBR３２２－類的質(zhì)粒，從經(jīng)氯霉素處理和未經(jīng)處理的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒的產(chǎn)量迥然不同,，前者大為增高,。多年來，加入足以*抑制蛋白質(zhì)合成的氯霉素μg/ml)已成為標準的操作,、用該方法提取的質(zhì)粒DNA量,，對于分子克隆中幾乎所有想象到的工作任務。
（二）細菌的收獲和裂解
細菌的收獲可通過離心來進行,，而細菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種,，這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決于３個因素：質(zhì)粒的大小,、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質(zhì)粒DNA的技術,。 盡管針對質(zhì)粒和宿主的每一種組合分別提出的裂解條件不切實際，但仍可據(jù)下述一般準則來選擇適當方法,，以取得滿意的結果,。
1)大質(zhì)粒(大于15kb)容易受損，故應采用漫和裂解法從細胞中釋放出來,。將細菌懸于蔗糖等滲溶液中,，然后用溶菌酶和EDTA進生處理，破壞細胞壁和細胞外膜,，再加入SDS一類去污劑溶解球形體,。這種方法zui大限度地減小了從具有正壓的細菌內(nèi)部把質(zhì)粒釋放出來所需要的作用力。
2)可用更劇烈的方法來分離小質(zhì)粒,。在加入EDTA后,，有時還在加入溶菌酶后讓細菌暴露于去污劑，通過煮沸或堿處理使之裂解,。這些處理可破壞堿基配對,，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓撲纏繞狀態(tài)而不能彼此分開,。當條件恢復正常時,，質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準確配置，重新形成*天然的超螺旋分子,。
3)一些大腸桿菌菌株(如HB101的一些變種衍生株) 用去污劑或加熱裂解時可釋放相對大量的糖類,，當隨后用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心進行質(zhì)粒純化時它們會惹出麻煩。糖類會在梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒DNA所占位置形成一致密的,、模糊的區(qū)帶,。因此很難避免質(zhì)粒DNA內(nèi)污染有糖類，而糖類可抑制多種限制酶的活性,。 故從諸 如HB101和TG1等大腸桿菌蓖株中大量制備質(zhì)粒時,，不宜使用煮沸法。
4)當從表達內(nèi)切核酸酶A的大腸桿菌菌株(endA+株,，如HB101) 中小量制備質(zhì)粒時,，建議不使用煮沸法。因為煮沸不能*滅活內(nèi)切核酸酶A,，以后在溫育(如用限制酶消化)時,，質(zhì)粒DNA會被降解。但如果通過一個附加步驟(用酚：進行抽提)可以避免此問題,。
５)目前這一代質(zhì)粒的拷貝數(shù)都非常高,，以致于不需要用氯霉素進行選擇性擴增就可獲得高產(chǎn),。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量,，而是要降低細菌細胞在用于大量制備的溶液中所占體積,。大量高度粘稠的濃縮細菌裂解物，處理起來煞為費事,，而在對數(shù)中期在增減物中加入氯霉素可以避免這種現(xiàn)象,。有氯霉素存在時從較少量細胞獲得的質(zhì)粒DNA的量以與不加氯霉素時從較大量細胞所得到的質(zhì)粒DNA的量大致相等。
(三)質(zhì)粒DNA的純化