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用PCR擴(kuò)增cDNA庫(kù)中的特異序列
點(diǎn)擊次數(shù)：1442 發(fā)布時(shí)間：2017-6-7
zui常用的基因分離方法需要建立組織或細(xì)胞RNA的cDNA庫(kù),，然后用抗體或 DNA探針篩選出感興趣的基因,。雖然這個(gè)方法已成功地克隆了大量基因，但建立和篩 選CDNA庫(kù)是一項(xiàng)非常耗時(shí)．費(fèi)力的工作,，而且用寡聚核苷酸作探針進(jìn)行篩選需大量蛋 白質(zhì)序列結(jié)構(gòu)的資料,。聚合酶鏈的反應(yīng)（PCR）方法可使一種特異DNA擴(kuò)增幾百萬(wàn)倍， 并已成為分子克隆和診斷的十分有用的工具,。zui近,，TAQDNA聚合酶的使用極大地簡(jiǎn)化 了PCR方法,。該酶在75℃左右有很寬的zui適溫度區(qū)，在小于95℃以下重復(fù)保溫仍能存 活,，更重要的是,，該酶活性高，無(wú)外切酶活性,，因此理論上不用通過建立和篩選基因 庫(kù)的所用步驟就能從序列編碼的基因作模板以探索一種簡(jiǎn)單．快速的基因分離方法,。 下面我們將描述在鑒定南美蝙蝠唾液腺外分泌蛋白中使用的方法和過程。
Dr.S.Gardell(MSDRL,，WestPoint,，PA)純化了從南美蝙蝠唾液腺中分離的一種外 分泌蛋白，因此其部分肽序列(GlyLeuGlyCysAspLeuMet)是開始本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵,。為檢 驗(yàn)不用傳統(tǒng)篩選方法即能克隆該蛋白基因的假說,，我們采取了如下策略:
a).在Lambdagt22中建立一個(gè)在蝙蝠唾液腺中所有轉(zhuǎn)錄子的cDNA庫(kù)，并在邊側(cè)加 上SP6,、T6聚合酶啟動(dòng)子,，這樣可以直接用兩種啟動(dòng)子序列之一作引物進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè) 序。
b).合成四組引物,，組合起來代表已知的部分蛋白序列的全部有效密碼子組合 (1024種衍生列),。C).這些引物與適當(dāng)?shù)腡7或SP6聚合酶序列引物組合成對(duì)，以總cDNA 庫(kù)作模板,，進(jìn)行pcr擴(kuò)增,。所得到PCR產(chǎn)物應(yīng)該代表編碼該蛋白的部分cDNA。對(duì)這些 PCR產(chǎn)物直接測(cè)序應(yīng)能得到足的序列信息以合成同源引物,，進(jìn)一步進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，產(chǎn)生 的DNA片段結(jié)合起來可給出編碼該蛋白的cDNA的完整序列。
直接用2%瓊脂糖凝膠分析PCR產(chǎn)物,，組混合引物