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植物細胞色素P450（CYP450）
點擊次數(shù)：1305 發(fā)布時間：2017-5-12
實驗原理：
本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中植物細胞色素P450（CYP450）水平,。用純化的植物細胞色素P450（CYP450）抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入細胞色素P450（CYP450）,，再與HRP標記的細胞色素P450（CYP450）抗體結(jié)合,，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色,。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的細胞色素P450（CYP450）呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，通過標準曲線計算樣品中植物細胞色素P450（CYP450）濃度。
標本要求：
1．標本采集后盡早進行提取,，提取按相關(guān)文獻進行,，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,，可將標本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融
2．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性,。
操作步驟：
1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設(shè)標準品孔10孔,，在*,、第二孔中分別加標準品100μl，然后在*,、第二孔中加標準品稀釋液50μl,，混勻；然后從*孔,、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三,、第四孔分別加標準品稀釋液50μl,，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉,，再各取50μl分別加到第五,、第六孔中，再在第五,、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul,，混勻；混勻后從第五,、第六孔中各取50μl分別加到第七,、第八孔中，再在第七,、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl,，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九,、第十孔中,，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉,。（稀釋后各孔加樣量都為50μl,，濃度分別為300 pmol/L,200pmol/L ,100 pmol/L, 50pmol/L,25 pmol/L）。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑,，其余各步操作相同）,、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl（樣品zui終稀釋度為5倍）,。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動混勻,。
3. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
4. 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用,。
5. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體,，甩干，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去,，如此重復(fù)5次，拍干,。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl,，空白孔除外。