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細胞培養(yǎng)的方法介紹
點擊次數(shù)：1540 發(fā)布時間：2017-2-20
1,、復(fù)蘇細胞
1）液氮中取出所要的細胞,，37℃水浴鍋中快搖，勿讓水入蓋,，同時將培養(yǎng)液放入37℃水浴鍋中溫育,；
2）將細胞離心，同時進入超凈臺,，無菌操作,，將培養(yǎng)液瓶用衛(wèi)生紙擦干，除菌后放入超凈臺,，將蓋子打開,，瓶子放在架子上,，瓶口朝火焰，將吹打吸管滅菌后吸部分培養(yǎng)液進入培養(yǎng)皿,；
3）離心完畢,，將細胞凍存液傾倒掉，吸入約1ml培養(yǎng)液到凍存管中,，反復(fù)吹打,，懸起細胞，吸入皿中,，吹打,，標好；
4) 顯微鏡下觀察,，呈圓形,，不結(jié)塊，不聚在一起,，濃度適宜并且均勻,，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
2,、傳代：
1）倒掉培養(yǎng)液,，加含5%胰酶的培養(yǎng)液（T/E），37度或室溫消化10-15min,，顯微鏡下觀察細胞是否脫落,，脫落*后吸入無菌離心管；
2）離心,，加適量培養(yǎng)液重懸分裝到培養(yǎng)皿中,；
3）顯微鏡下觀察后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
3,、轉(zhuǎn)染細胞：
1）計算所要轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒量和lipofectamin量,，如60mm CHO-1K，10μg 質(zhì)粒/well加20μl LF2000,；
2）37℃水浴鍋中溫育培養(yǎng)液,，500μl Opti-MEM 加質(zhì)粒 溫育5min，同時500μl Opti-MEM 加 LF2000 溫育小于5min,；
3）將上述兩份混合在一起形成Mix,，室溫溫育20min；
4）溫育同時,，用無血清培養(yǎng)基（D/F）洗2-3次,，晃幾晃；
5）在所要轉(zhuǎn)染的細胞中加入1-2ml D/F,，再將溫育完畢的Mix加入細胞中,，晃均勻,，顯微鏡下觀察后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
6) 培養(yǎng)6-8小時后觀察,，細胞如果一切正常的話,，換含血清的培養(yǎng)基，換液時要洗2-3次,，換液后繼續(xù)培養(yǎng)24-36小時,。
配方：
IMDM培養(yǎng)液（購自GIBCO公司)，含10%胎牛血清(FBS),、1%非必需氨基酸,、1μM 二氫睪酮（DHT）（培養(yǎng)附睪上皮細胞需要加，COS7不用）（以上均購自PAA公司）,；
T/E：培養(yǎng)基中含有：5%胰蛋白酶,，0.53M EDTA ）