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動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)及外源基因的導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)
點(diǎn)擊次數(shù)：1370 發(fā)布時(shí)間：2016-12-5
細(xì)胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物學(xué)研究中應(yīng)用的技術(shù)之一。它的突出優(yōu)點(diǎn)，一是研究對象是活的細(xì)胞,，可長時(shí)期地監(jiān)控,、檢測甚至定量評估其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命活動(dòng)等,；二是可以人為地嚴(yán)格控制研究條件,，便于研究各種物理、化學(xué),、生物等外界因素對細(xì)胞生長,、發(fā)育和分化等的影響，有利于單因子分析,；三是研究的樣本可以達(dá)到比較均一性,。常用的細(xì)胞系均是性質(zhì)均一的細(xì)胞，需要時(shí)還可采用克隆化等方法使細(xì)胞進(jìn)一步純化,；四是研究的內(nèi)容便于觀察,、檢測和記錄。體外培養(yǎng)的細(xì)胞可采用顯微鏡,，電鏡等直接觀察記錄,，充分滿足實(shí)驗(yàn)的要求。另外還具有研究范圍比較廣泛,，研究費(fèi)用相對經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn),。
然而，細(xì)胞培養(yǎng)也有其局限性,。由于培養(yǎng)的細(xì)胞脫離了機(jī)體復(fù)雜的環(huán)境條件,，其細(xì)胞形態(tài)和功能都會(huì)發(fā)生一定程度的改變。尤其是體外反復(fù)傳代,、長期培養(yǎng)的細(xì)胞,，有可能發(fā)生染色體非二倍體改變等情況。因此,，應(yīng)將體外培養(yǎng)的細(xì)胞視為一種既保持動(dòng)物體內(nèi)原細(xì)胞一定的性狀又具有某些改變的特定的細(xì)胞群體,。
由于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是其他實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)所不能比擬的，所以近年來細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在分子生物學(xué),、細(xì)胞生物學(xué),、遺傳學(xué)、老年學(xué),、免疫學(xué),、腫瘤學(xué)和病毒學(xué)等很多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用，其中對于分子生物學(xué)家及細(xì)胞生物學(xué)家而言,，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)對感興趣的基因產(chǎn)物進(jìn)行定位,、運(yùn)動(dòng)及功能研究變得越來越重要。在克隆一個(gè)基因后的下一步，往往是將其導(dǎo)入不同類型細(xì)胞,，以分析其表達(dá),，測定表達(dá)對細(xì)胞生長的影響，或?qū)⒏弑磉_(dá)的基因產(chǎn)物純化,。將外源DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞有兩種途徑：穩(wěn)定（*）或暫時(shí)性轉(zhuǎn)染,。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的目的是將轉(zhuǎn)移基因整合到細(xì)胞染色體DNA上，形成穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)移基因的細(xì)胞系,。一般需要共轉(zhuǎn)染一個(gè)選擇標(biāo)記,，用于追蹤轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞或轉(zhuǎn)染效率。暫時(shí)性轉(zhuǎn)染的目的是為了分析轉(zhuǎn)移基因的暫時(shí)轉(zhuǎn)錄或表達(dá),，一般在轉(zhuǎn)染后1-4天內(nèi)進(jìn)行,。針對培養(yǎng)細(xì)胞的外源DNA導(dǎo)入已發(fā)展出多種技術(shù)，其中常用的有磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染,，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染,，脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，電穿孔法等,。這4種方法除DEAE-葡聚糖法外,，均可用于暫時(shí)性轉(zhuǎn)染和*性轉(zhuǎn)染,。但它們有各自適用的細(xì)胞系,。培養(yǎng)的細(xì)胞不同，其在攝取和表達(dá)外源DNA的能力上可能存在幾個(gè)數(shù)量級的差異,。因此針對細(xì)胞系優(yōu)化并比較幾種不同方法的效率很重要,。
Graham和Vander EB（1973）報(bào)告了用Ca3(PO4)2-DNA沉淀將腺病毒SV40導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法，Wigler等（1978）證明這種方法也能用于導(dǎo)入并在哺乳動(dòng)物染色體上穩(wěn)定整合外源DNA,。至今對于磷酸鈣介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染的確切機(jī)理仍不清楚,。一般認(rèn)為轉(zhuǎn)移DNA通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，然后進(jìn)入細(xì)胞核,，而CaPO4處理被認(rèn)為是產(chǎn)生了一種能促使DNA附著在細(xì)胞表面的環(huán)境,。
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生命現(xiàn)象，對于機(jī)體的組織發(fā)育,、器官分化及多種病理過程均具有重要作用,。細(xì)胞凋亡具有典型的形態(tài)學(xué)及生化特征。包括細(xì)胞膜皺縮,，胞間連接減少,，染色體凝集，細(xì)胞核崩解并形成凋亡小體等,。其中一個(gè)強(qiáng)有力的生化指標(biāo)是“DNA Ladder”的產(chǎn)生,，由于凋亡相關(guān)的特異核酸酶在凋亡過程中的激活，凋亡細(xì)胞的總DNA可以在核小體間進(jìn)行切割，提取總DNA進(jìn)行電泳可以形成間隔180-200bp的階梯狀電泳條帶（DNA Ladder）,。一般認(rèn)為出現(xiàn)DNA Ladder 的細(xì)胞肯定發(fā)生了凋亡,，但并非所有發(fā)生凋亡的細(xì)胞都會(huì)出現(xiàn)DNA Ladder。這種檢測方法也受到靈敏性的限制,，只有當(dāng)?shù)蛲黾?xì)胞占到細(xì)胞總量的15%以上時(shí),，特異降解的DNA經(jīng)過電泳才會(huì)較好地顯示DNA Ladder。