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cDNA合成的隨機引物法
點擊次數：4472 發(fā)布時間：2016-8-30
cDNA合成時，合成*鏈目前主要有三種方法,。而且每一種方法之間存在著差異性,，這些相對的特異性使得所得到的cDNA的數量和種類有所不同。這篇文章為大家介紹隨機引物法的優(yōu)劣勢和特性,。
隨機引物法是三種方法中特異性zui低的。引物在整個轉錄本的多個位點退火,，產生短的,，部分長度的cDNA。這種方法經常用于獲取5"末端序列及從帶有二級結構區(qū)域或帶有逆轉錄酶不能復制的終止位點的RNA模板獲得cDNA,。為了獲得zui長的cDNA,，需要按經驗確定每個RNA樣品中引物與RNA的比例。隨機引物的起始濃度范圍為50到250ng每20μl反應體系,。因為使用隨機引物從總rna合成的cDNA主要是核糖體RNA,，所以模板一般選用poly(A)+RNA。
Oligo(dT)起始比隨機引物特異性高,。它同大多數真核細胞mRNA 3"端所發(fā)現的poly(A)尾雜交,。因為poly(A)+RNA大概占總RNA的1%到2%，所以與使用隨機引物相比,，cDNA的數量和復雜度要少得多,。因為其較高的特異性，oligo(dT)一般不需要對RNA和引物的比例及poly(A)+選擇進行優(yōu)化,。建議每20μl反應體系使用0.5μg oligo(dT),。oligo(dT)12-18適用于多數RT-PCR。thermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20,，因為其熱穩(wěn)定性較好,，適用于較高的保溫溫度。
基因特異性引物(GSP)對于逆轉錄步驟是特異性的引物。GSP是反義寡聚核苷,，可以特異性地同RNA目的序列雜交,，而不象隨機引物或oligo(dT)那樣同所有RNA退火。用于設計PCR引物的規(guī)則同樣適用于逆轉錄反應GSP的設計,。GSP可以同與mRNA3"zui末端退火的擴增引物序列相同,，或GSP可以設計為與反向擴增引物的下游退火。對于部分擴增對象,，為了成功進行RT-PCR,，需要設計多于一個反義引物，因為目的RNA的二級結構可能會阻止引物結合,。建議在20μl的*鏈合成反應體系中使用1pmol反義GSP,。
提高逆轉錄保溫溫度
為了充分利用GSP特異性的全部優(yōu)點，應該使用有較高熱穩(wěn)定性的逆轉錄酶,。熱穩(wěn)定逆轉錄酶可以在較高溫度保溫以增加反應嚴謹性,。比如，如果一個GSP退火溫度為55℃,，那么如果使用AMV或M-MLV在低嚴謹性的37℃進行逆轉錄,，GSP所帶有的特異性就沒有*利用。然而SuperScripⅡ和ThermoScript可以在50℃或更高進行反應,，(表2)這就會消除較低溫度時產生的非特異性產物(圖10),。為獲得zui大的特異性，可以將RNA/引物混合物直接從65℃變性溫度轉移到逆轉錄保溫溫度,，并加入預熱的2×反應混合液(cDNA合成熱啟動),。這有助于防止低溫時分子間堿基配對。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度轉換,。
使用ThermoScript™和設計用來同人dna聚合酶εmRNA退火的GSP,，由1μg Hela RNA合成cDNA。Thermoscript加入到預熱的反應混合液中,，使用Platinum Taq DNA聚合酶對1/10的cDNA進行35個循環(huán)的PCR,。
減少基因組DNA污染
RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中沾染的基因組DNA。使用較好的RNA分離方法,，如Trizol Reagent,，會減少RNA制備物中沾染的基因組DNA。為了避免產生于基因組DNA的產物,，可以在逆轉錄之前使用擴增級的DNaseⅠ對RNA進行處理以除去沾染的DNA,。將樣品在2.0mM EDTA中65℃保溫10分鐘以終止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合鎂離子,，防止高溫時所發(fā)生的依賴于鎂離子的RNA水解,。
通常我們通過設計不同的外顯子退火引物來將合成的cDNA與合成的沾染的基因組DNA分開,。因為來自cDNA的PCR合成物短于沾染的基因組DNA的合成物，通常實驗人員會針對于單個的RNA模板做一個沒有逆轉錄的參照實驗,，目的在于鑒定這一個給定的片段產生于基因組DNA還是cDNA,。實驗結果應該是在沒有逆轉錄發(fā)生的這一組實驗中所得到的基因產物應該來自基因組。