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引物延伸分析實驗
點擊次數(shù)：2077 發(fā)布時間：2016-8-22
引物延伸分析用于定量mRNA的量,，測定低豐度的mRNA的種類。另外引物延伸實驗可標(biāo)定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5`-端,， 確定轉(zhuǎn)錄的起始,。特異的末端標(biāo)記的引物退火到RNA鏈的互補(bǔ)區(qū)域，隨后用RNA作為模板,，用反轉(zhuǎn)錄酶延伸引物得到cDNA,，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析cDNA。cDNA的長度為引物的標(biāo)記的核苷酸到RNA-5`末端間的堿基數(shù),，所得cDNA的量和目的RNA的起始量成正比,。理想的引物是ssDNA, 長度為20-40個核苷酸，與要分析的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的5`末端區(qū)域互補(bǔ),。延伸產(chǎn)物小于150個核苷酸,，可得到*分離效果。引物延伸實驗非常靈敏,，可檢測2 pg的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,，這相當(dāng)于1個細(xì)胞中的1個RNA。引物延伸實驗非常適合于對單個基因作定量和定性分析,。
（1）引物延伸分析所用試劑：引物延伸實驗需要模板RNA,，可用總RNA或poly(A)+RNA。一個特異的末端標(biāo)記的核苷酸或DNA片段作為引物,，用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA,。除RNA模板和標(biāo)記的引物,，還需要反轉(zhuǎn)錄酶，AMV或MMLV反轉(zhuǎn)錄酶,、反應(yīng)溶液,、脫氧核苷酸、聚丙烯酰胺凝膠試劑,，和電泳裝置,。所得結(jié)果用放射自顯影和磷成像儀分析。
（2）引物延伸系統(tǒng)的組分：引物延伸系統(tǒng)中AMV反轉(zhuǎn)錄酶和反應(yīng)溶液,、焦磷酸鈉,、正對照RNA模版和對照引物、去磷酸的PhiX174Hinf I DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子參照物,、T4多核苷酸激酶和溶液,、樣品溶液、AMV反轉(zhuǎn)錄酶2X溶液100 mM Tris-HCl（pH8.3, 42℃）,、100 mM KCl,、 20 mM MgCl2、20 mM DTT,、2 mM每一種dNTP,、1 mM精胺。PhiX174標(biāo)準(zhǔn)分子參照物和T4 多核苷酸激酶用作引物標(biāo)記,，和確定延伸產(chǎn)物長度的標(biāo)準(zhǔn),。對照RNA可得到87個堿基的延伸產(chǎn)物作為正對照。引物延伸反應(yīng)中用焦磷酸鈉和精胺可增加全長cDNA的得率,，抑制模板RNA產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu),。雖然其作用方式未確定，但結(jié)果是增加全長cDNA的得率,，抑制模板RNA產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu),。MMLV被焦磷酸鈉和精胺抑制，如使用MMLV,，放線菌素D可用于增加全長cDNA的得率,，抑制模板RNA產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu)。焦磷酸鈉和放線菌素D抑制cDNA第二條鏈的合成,。
（3）引物延伸實驗的優(yōu)化：
①雜交溫度,。
引物延伸實驗中所用的雜交溫度是zui關(guān)鍵的需優(yōu)化的因素。一般而言,，zui高緊密度,，或引物和互補(bǔ)序列*雜交所需的zui適條件是，低于引物溶解溫度的5oC,。低于zui高緊密度的溫度可極大地增加雜交速度,。應(yīng)在不同的緊密度的雜交溫度下作雜交,，以控制引物和特異RNA的雜交。增加雜交緊密度時,，帶來的延伸產(chǎn)物的丟失表明,，引物和相關(guān)的卻不是等同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物雜交。在堿和雙價陰離子的存在下,，RNA在較高溫度會降解,，應(yīng)用甲酰胺雜交操作方案，這可有效降低溶解溫度,，因此可使雜交在較低的溫度進(jìn)行,。可在雜交步驟中用以下的溶液：40mMPIPES,、1mMEDTA,、0.4mM NaCl、80%的甲酰胺,。如用這個雜交溶液,，延伸步驟前甲酰胺和鹽需用乙醇沉淀后除去。
②模板RNA和引物的量,。
以下討論了所用RNA模板和引物的起始量,。反轉(zhuǎn)錄酶對不同模板使用的效率不同。這部分是由于RNA中存在的次級結(jié)構(gòu)干擾反轉(zhuǎn)錄酶的聚合酶活力,。如產(chǎn)生短的產(chǎn)物，這通常不是一個問題,。如用AMV反轉(zhuǎn)錄酶,，延伸溫度可達(dá)55℃。
③每次反應(yīng)所用RNA的量,。
每次反應(yīng)所用RNA和引物的量取決于分析的RNA的種類（總RNA或poly(A) + RNA）,，目的RNA的相對豐度。如用總RNA,，起始量為10ug,，但分析稀有信號，每次反應(yīng)用100 ugRNA,。poly(A)+RNA每次反應(yīng)用0.1-1.0 ug,，具體決定于總RNA中poly(A)+RNA的富含量，需分析的特異RNA的濃度,。在引物延伸分析前需檢查目的RNA的完整,。通過凝膠分析總RNA，應(yīng)有完整的18S和28S核糖體RNA帶,。在引物延伸反應(yīng)中用Northern印跡和RT-PCR分析來確定特定RNA的存在,。