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培養(yǎng)箱中微生物菌種保藏方法及注意點(diǎn)
閱讀：3232 發(fā)布時(shí)間：2019-12-131,、傳代保存法：有些微生物當(dāng)遇到冷凍或干燥等處理時(shí)，會(huì)很快死亡,，因此在這種情況下,，只能求助于傳代培養(yǎng)保存法。傳代培養(yǎng)就是要定期地進(jìn)行菌種轉(zhuǎn)接,、培養(yǎng)后再保存,，它是基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生產(chǎn)菌種的保存,。
傳代保存時(shí),，培養(yǎng)基的濃度不宜過高，營(yíng)養(yǎng)成分不宜過于豐富,，尤其是碳水化合物的濃度應(yīng)在可能的范圍內(nèi)盡量降低,。培養(yǎng)溫度通常以稍低于適生長(zhǎng)溫度為好,。若為產(chǎn)酸菌種,，則應(yīng)在培養(yǎng)基中添加少量碳酸鈣。
一般地,，大多數(shù)菌種的保藏溫度以5℃為好,，像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃進(jìn)行保存,，而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存,。
傳代培養(yǎng)保存法雖然簡(jiǎn)便，但其缺點(diǎn)也很明顯,，如：①菌種管棉塞經(jīng)常容易發(fā)霉,；②菌株的遺傳性狀容易發(fā)生變異；③反復(fù)傳代時(shí),，菌株的病原性,、形成生理活性物質(zhì)的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期轉(zhuǎn)種,，工作量大,；⑤雜菌的污染機(jī)會(huì)較多。
2,、液體石蠟覆蓋保存法：該法較前一種方法保存菌種的時(shí)間更長(zhǎng),，適用于霉菌、酵母菌,、放線菌及需氧細(xì)菌等的保存,。此法可防止干燥,，并通過限制氧的供給而達(dá)到削弱微生物代謝作用的目的。其具有方法簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn),，同時(shí)也適用于不宜冷凍干燥的微生物（如產(chǎn)孢能力低的絲狀菌）的保存,，而某些細(xì)菌如固氮菌、乳酸桿菌,、明串珠菌,、分枝桿菌、紅螺菌及沙門氏菌等和一些真菌如卷霉菌,、小克銀漢霉,、毛霉、根霉等不宜采用此法進(jìn)行保存,。
3,、載體保存法：即將微生物吸附在適當(dāng)載體上進(jìn)行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種,，如①土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏,。方法是在滅菌的土壤中加入菌液，立即在室溫下進(jìn)行干燥或使菌體繁殖后再干燥,，然后冷藏或在室溫下密封保存,。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜，土壤需風(fēng)干,、粉碎,、過篩和滅菌。
使微生物在土壤中繁殖后進(jìn)行干燥保存的方法是：取適量土壤（5克）置于塞有棉塞的試管中,，加水或加入充分稀釋的液體培養(yǎng)基（以含水量為土壤大持水量的60%為宜）,，然后高壓滅菌。再將需保存的微生物進(jìn)行大量接種,，培養(yǎng)至菌絲能用肉眼確認(rèn)的程度為止,，移入干燥器中經(jīng)短時(shí)間干燥或風(fēng)干后密封，冷藏或室溫保存,。
?、谏巴帘４娣ǎ喝∏鍧嵉纳埃^60目篩去掉大砂粒,，并用磁鐵吸去砂中鐵屑,，再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗數(shù)次,，干燥后,，置于試管或安瓶管中保持2～3cm深，再經(jīng)干熱滅菌后,，加入1ml菌種培養(yǎng)液,，經(jīng)充分混勻后,，放入真空干燥器中，*干燥后熔封保存,。也可用二份洗凈的砂（經(jīng)HCl預(yù)處理）和一份貧瘠,、過篩的黃土攙和后滅菌，再進(jìn)行菌種保藏,。
?、酃枘z保存法：以6～16目的無色硅膠代替砂子，干熱滅菌后,，加入菌液,。加菌液時(shí)，由于硅膠的吸附熱常使溫度升高,，因而需設(shè)法加以冷卻,。
④磁珠保存法：將菌液浸入素?zé)胖椋ɑ蚨嗫撞Ａе椋┖笤龠M(jìn)行干燥保存的一種方法,。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠（或無水CaSO4）,，上鋪玻璃棉，再放上10～20粒磁珠,，經(jīng)干熱滅菌后,，接入菌懸液，后冷藏,、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏,。本法對(duì)酵母菌很有效，特別適用于根瘤菌,，可保存長(zhǎng)達(dá)兩年半時(shí)間。
?、蓰熎け４娣ǎ涸邴熎?nèi)加入60%的水,，經(jīng)滅菌后接種培養(yǎng)，后干燥保藏,。
?、藜埰V紙）保存法：將滅菌紙片浸入培養(yǎng)液或菌懸液中，常壓或減壓干燥后,，置于裝有干燥劑的容器內(nèi)進(jìn)行保存,。
4、懸液保存法：即使微生物混懸于適當(dāng)溶液中進(jìn)行保存的方法,。常用的有,，①蒸餾水保存法：適用于霉菌、酵母菌及絕大部分放線菌,，將其菌體懸浮于蒸餾水中即可在室溫下保存數(shù)年,。本法應(yīng)注意避免水分的蒸發(fā),。
②糖液保存法：適用于酵母菌,，如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中,，然后于冷暗處保存，可長(zhǎng)達(dá)10年,。除此之外,，也可使用緩沖液或食鹽水等進(jìn)行保存。
5,、寄主保存法：即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法,。
6、冷凍保存法：適用于抗凍力強(qiáng)的微生物,。這些微生物可在其菌體細(xì)胞外遭受凍結(jié)的情況下而不受損傷,，而對(duì)其它大多數(shù)微生物而言，無論在細(xì)胞外凍結(jié)還是在細(xì)胞內(nèi)凍結(jié),，都會(huì)對(duì)菌體造成損傷,，因此當(dāng)采用這種保藏方法時(shí)，應(yīng)注意以下幾點(diǎn),，①要選擇適于冷凍干燥的菌齡細(xì)胞,；②要選擇適宜的培養(yǎng)基，因?yàn)槟承┪⑸飳?duì)冷凍的抵抗力,，常隨培養(yǎng)基成分的變化而顯示出巨大差異,；③要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高,，生存率越高,，保存期也越長(zhǎng)；④在菌液內(nèi)不添加電解質(zhì)（如食鹽等）,；⑤可在菌液內(nèi)添加甘油等保護(hù)劑,，以防止在冷凍過程中出現(xiàn)菌體大量死亡的現(xiàn)象。同樣,，也可添加各種糖類,、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護(hù)效果的溶劑，但對(duì)有些微生物而言,，不加保護(hù)劑時(shí)更有效,。
⑥原則上應(yīng)盡快進(jìn)行冷凍處理,，但當(dāng)加入保護(hù)劑時(shí),，可靜置一段時(shí)間后再進(jìn)行處理。
⑦就動(dòng)物細(xì)胞而言,，應(yīng)在－20℃范圍內(nèi)以1℃/min左右的速度緩慢降溫,，此后必須盡快降到貯藏溫度；而對(duì)絕大多數(shù)微生物而言,，則不必如此,，如結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的原蟲則可在－35℃范圍內(nèi)進(jìn)行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進(jìn)行冷凍,；⑧若進(jìn)行長(zhǎng)期保存,，則貯藏溫度越低越好；⑨取用冷凍保存的菌種時(shí),，應(yīng)采取速融措施,，即在35～40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說,，則應(yīng)選擇靜置融化的措施,。當(dāng)冷凍菌融化后，應(yīng)盡量避免再次冷凍,，否則菌體的存活率將顯著下降,。
常用的冷凍保存法包括：
①低溫冰箱保存法（－20℃,、－50℃或－85℃）：低溫冷凍保存時(shí)使用螺旋口試管較為方便,，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時(shí)菌液加量不宜過多,，有些可添加保護(hù)劑,。此外，也可用φ5mm的玻璃珠來吸附菌液,，然后把玻璃珠置于塑料容器內(nèi),，再放入低溫冰箱內(nèi)進(jìn)行保存的。
?、诟杀４娣ǎǎ?0℃左右）：即將菌種管插入干冰內(nèi),，再置于冰箱內(nèi)進(jìn)行冷凍保存。
?、垡旱４娣ǎǎ?96℃）：是適用范圍廣的微生物保存法。其操作步驟如下,，a,、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當(dāng)防凍劑（保存霉菌不用防凍劑）的滅菌溶液中，將0.2～1ml的這種溶液分裝于安瓶中,，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種,，或?qū)⒕z體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。
b、熔封安瓶管：若直接貯存于氣相液氮中（－150℃～－170℃）時(shí),，則不需熔封,。
c、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下,，將熔封安瓶管在適當(dāng)?shù)纳厝芤褐薪?～30分鐘后,，觀察有無色素進(jìn)入安瓶。
d,、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置于小罐中,，然后用液氮?dú)庖约s1℃/min的速度冷卻至－25℃左右，也可在－20℃～－25℃的冰箱內(nèi)緩慢冷卻30～60min,。
e,、速冷：后浸入液氮中快速冷卻至－196℃。
7,、冷凍干燥保存法：其原理是首先將微生物冷凍,，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分。事實(shí)上,，從菌體中除去大部分水分后,，細(xì)胞的生理活動(dòng)就會(huì)停止，因此可以達(dá)到長(zhǎng)期維持生命狀態(tài)的目的,。該方法適用于絕大多數(shù)微生物菌種（包括噬菌體和立克次氏體等）的保存,。
在進(jìn)行冷凍干燥時(shí)，需注意以下幾個(gè)問題：
a,、冷凍干燥前的培養(yǎng)條件：首先檢驗(yàn)菌種純度,。一般地說，將待保存的微生物在營(yíng)養(yǎng)豐富且容易增菌的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)為宜,；菌齡以達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為好,；若為有芽孢或孢子的微生物，則以芽孢和孢子形成以后進(jìn)行保存為好,；菌液濃度以高為好,，如細(xì)菌應(yīng)達(dá)到109～1010/ml。
b,、菌株號(hào)碼等的標(biāo)記：可在安瓶外側(cè)標(biāo)記或在安瓶?jī)?nèi)封入標(biāo)簽,。
c、安瓶的準(zhǔn)備：將安瓶在2%HCl中浸泡過夜,，自來水沖洗3次后,，蒸餾水刷凈，干燥,，塞棉塞,，貼標(biāo)簽，干熱滅菌或溫?zé)釡缇螅?0℃恒溫干燥。
d,、添加保護(hù)劑：常用的保護(hù)劑有脫脂乳,、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等等,。
8,、Bordelli氏法：取干凈的小試管（8×60mm）塞上棉塞，滅菌,。用滅菌的脫脂牛乳洗脫試管斜面上的菌苔,，制成濃厚菌懸液。然后用無菌吸管將菌懸液滴入小試管底部,。每管一滴,，然后轉(zhuǎn)動(dòng)小試管使菌液分散在試管底部的壁上。標(biāo)記菌名,。將小試管裝在15×150mm的試管中,，在大試管底部事先裝上1.5cm高的（P2O5或KOH），管口用帶玻璃管的橡皮塞塞緊,，蠟封,。將大試管與真空泵連通，抽真空至0.1～0.2mm汞柱時(shí),，將玻璃管熔封,，置室溫暗處或冰箱保存。
儀器與材料1,、斜面菌種：絲狀真菌,、酵母菌、芽孢桿菌和無芽孢桿菌各一支,。
2,、接種用具一套。
3,、滅菌物品：1ml,、5ml吸管，長(zhǎng)滴管,，安瓶管,，9ml無菌水試管，砂土管,，液體石蠟,，脫脂牛乳。其中,，液體石蠟的處理為1.5kg/cm2壓力滅菌1小時(shí)或1kg/cm2壓力滅菌3次，每次30分鐘。接著檢查是否*無菌,，即接入肉湯中檢查有無雜菌生長(zhǎng),。后放在60～80℃轟烤以去除水分。脫脂牛乳的處理為2000rpm離心10分鐘脫脂,，然后0.5kg/cm2壓力滅菌20分鐘,，或間歇滅菌3次，經(jīng)檢查無菌后備用,。
4,、P2O5，無水CaCl2各一瓶,。
5,、真空干燥器，真空泵,。
方法1,、液體石蠟覆蓋法：取待保存的菌種斜面，用5ml無菌吸管向內(nèi)加入滅菌石蠟,，要求液體石蠟高出菌斜面1cm左右,，若不夠此高度，則常會(huì)引起斜面抽干現(xiàn)象,。
2,、砂土管法：用1ml無菌吸管吸取0.2～0.5ml菌懸液，滴入砂土管中,，充分混勻后,，將砂土管放入真空干燥器內(nèi)，抽干,，真空干燥器內(nèi)需放置無水CaCl2,。后，將干燥好的砂土管取出,，迅速于火焰上蠟封管口,，并在室溫下或冰箱中進(jìn)行保存。
3,、冷凍干燥保藏法：
?、儆脺缇L(zhǎng)滴管取出2滴（約0.1ml）無菌脫脂牛乳，置于無菌安瓶管中,，然后用另一支無菌滴管取出等體積的濃菌液,，同樣置于此安瓶管中，充分混勻,。
?、诩邪财抗?，置于100ml燒杯中，將燒杯裝進(jìn)真空冷凍干燥器的鐘罩內(nèi),，開機(jī)并開冷卻水后,，使菌液在－20℃溫度下迅速凍結(jié)成固體，然后抽真空使水分升華,，2小時(shí)后,，可以停止冷凍并在稍高的溫度下進(jìn)行干燥，直至全干為止,。
?、酆笕〕霭财抗埽⑵渑c真空泵連接,，再抽真空后,，迅速將安瓶管熔封，后冰箱保存,。
4,、甘油管保藏法：在5ml菌種保藏管中，將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻后,，于－20℃冰箱中保存,。