人心型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-FABP)試劑盒

本試劑盒僅供體外研究使用!

預(yù)期應(yīng)用

ELISA法定量測(cè)定人血清,、血漿或其它相關(guān)生物液體中心型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-FABP)含量,。

人心型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-FABP)試劑盒

實(shí)驗(yàn)原理

用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體,，往包被抗  h-FABP抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品,、生物素化的抗  h-FABP抗體、HRP標(biāo)記的親和素,，經(jīng)過(guò)*洗滌后用底物  TMB顯色,。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的 h-FABP呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（ OD值），計(jì)算樣品濃度,。

試劑盒組成及試劑配制

1. 酶聯(lián)板：一塊（96孔）
2. 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶,，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上,，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解,，其濃度為150 ng/ml，請(qǐng)先稀釋至30 ng/ml，再做系列倍比稀釋(注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋)后,，分別稀釋成30 ng/ml,，15 ng/ml，7.5 ng/ml,，3.75 ng/ml,，1.88 ng/ml，0.94 ng/ml,，0.47 ng/ml,，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 ng/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制,。如配制15 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml (不要少于0.5ml ) 30 ng/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中,，混勻即可，其余濃度以此類推,。
3. 樣品稀釋液：1×20ml,。
4. 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5. 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml,。
6. 檢測(cè)溶液A：1×120μl（1:100）臨用前以檢測(cè)稀釋液A 1:100稀釋,，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（100μl/孔），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制  0.1-0.2ml,。如10μl檢測(cè)溶液A加990μl檢測(cè)稀釋液A的比例配制,，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制,。
7. 檢測(cè)溶液B：1×120μl/瓶（1:100）臨用前以檢測(cè)稀釋液B 1:100稀釋,。稀釋方法同檢測(cè)溶液A。
8. 底物溶液：1×10ml/瓶,。
9. 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋25倍,。
10. 終止液：1×10ml/瓶（2N H₂SO4）,。
11. 覆膜：5張
12. 使用說(shuō)明書：1份

人心型脂肪酸結(jié)合蛋白(h-FABP)試劑盒

自備物品

1.   酶標(biāo)儀（建議參考儀器使用說(shuō)明提前預(yù)熱）

2.   微量加液器及吸頭，EP管

3.   蒸餾水或去離子水,，全新濾紙

標(biāo)本的采集及保存

1. 血清：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃一夜后于1000 x g離心20分鐘,，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
2. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘,，或將標(biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 其它生物標(biāo)本：請(qǐng)1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè),，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

注：以上標(biāo)本置4℃保存應(yīng)小于1周,，-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存,，-20℃不應(yīng)超過(guò)1個(gè)月，-80℃不應(yīng)超過(guò)2個(gè)月,；標(biāo)本溶血會(huì)影響zui后檢測(cè)結(jié)果,，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。

操作步驟

實(shí)驗(yàn)開始前,，各試劑均應(yīng)平衡至室溫（試劑不能直接在37℃溶解）,；試  劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻,，混勻時(shí)盡量避免起泡,。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)預(yù)測(cè)樣品含量，如樣品濃度過(guò)高時(shí),，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行稀釋,，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍，計(jì)算時(shí)再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù),。

1. 加樣：分別設(shè)空白孔,、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔,?？瞻卓准訕悠废♂屢?/span> 100μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100μl,，注意不要有氣泡,，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻,，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘,。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性,，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2. 棄去液體,，甩干,，不用洗滌。每孔加  檢測(cè)溶液A工作液 100μl（在使用前一小時(shí)內(nèi)配制）,，酶標(biāo)板加上覆膜, 37℃反應(yīng)60分鐘,。
3. 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板 3次,，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。
4. 每孔加檢測(cè)溶液B工作液（同檢測(cè)A工作液） 100μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃反應(yīng)60分鐘,。
5. 溫育60分鐘后,，棄去孔內(nèi)液體，甩干,，洗板5次,，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔,，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）,。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，酶標(biāo)板加上覆膜37℃避光顯色（30分鐘內(nèi),，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）,。
7. 依序每孔加終止溶液50μl,，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色,。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同,。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液,。
8. 用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）,。 在加終止液后立即進(jìn)行檢測(cè)。

注：

1.  試劑準(zhǔn)備：所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫,，使用后請(qǐng)立即按照說(shuō)明書要求保存試劑,。  實(shí)驗(yàn)操作中請(qǐng)使用一次性的吸頭，避免交叉污染,。

2.   加樣：加樣或加試劑時(shí),，請(qǐng)注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準(zhǔn)品,，酶結(jié)合物或底物時(shí),，*個(gè)孔與zui后一個(gè)孔加樣之間的時(shí)間間隔如果太大，將會(huì)導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育”時(shí)間,，從而明顯地影響到測(cè)量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性,。一次加樣時(shí)間（包括標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在  10分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用多道移液器加樣,。

3.   孵育：為防止樣品蒸發(fā),，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜,，以避免液體蒸發(fā),；洗板后應(yīng)盡快進(jìn)行下步操作，任何時(shí)侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時(shí)應(yīng)嚴(yán)格遵守給定的孵育時(shí)間和溫度,。

4.   洗滌：洗滌過(guò)程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干,，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時(shí)要消除板底殘留的液體和手指印,，避免影響zui后的酶 標(biāo)儀讀數(shù),。

5.  試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請(qǐng)手甩幾下或少時(shí)離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底,。標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測(cè)溶液A工作液、檢測(cè)溶液B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用,，并使用相應(yīng)的稀釋液配制,，不能混淆。請(qǐng)精確配置標(biāo)準(zhǔn)品及工作液,，盡量不要微量配置（如吸取檢測(cè)溶液A時(shí),，一次不要小于10μl），以避免由于不準(zhǔn)確稀釋而造成的濃度誤差,；請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品,、檢測(cè)溶液A工作液或檢測(cè)溶液B工作液。

6.  反應(yīng)時(shí)間的控制：加入底物后請(qǐng)定時(shí)觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如,，每隔10分鐘）,，如顏色較深，請(qǐng)?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng),，避免反應(yīng)過(guò)強(qiáng)從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù),。

7.  底物：底物請(qǐng)避光保存，在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射,。

    建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定,，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過(guò)高,，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定,，計(jì)算時(shí)請(qǐng)zui后乘以稀釋倍數(shù)。

洗板方法

1.  手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體,；在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙,，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次,；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘,，根據(jù)需要,，重復(fù)此過(guò)程數(shù)次。

2.  自動(dòng)洗板：如果有自動(dòng)洗板機(jī),，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,。

特異性

    本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的人h-FABP，且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng),。

計(jì)算

  以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)）,， OD值為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），在對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進(jìn)行分析,，如 curve expert 1.3，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式,，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度,。

檢測(cè)范圍：0.312 ng/ml-20 ng/ml

靈敏度：0.078 ng/ml